一株猪源粪肠球菌发酵培养基的优化
为提高一株分离自健康仔猪肠道的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的发酵活菌量，以MRS培养基为基础，对其发酵培养基进行优化，为此株粪肠球菌的工业化生产奠定基础。首先进行单因素优化确定最适碳源、最适氮源与最适pH，随后进行Plackett-Burman试验确定影响此株粪肠球菌发酵活菌数的显著因子，采用最陡上升路径试验得出显著因子逼近最大发酵活菌数的响应区域，最后利用Box-Behnken试验和响应曲面分析确定显著因子的最佳浓度。优化后的发酵培养基的配方为玉米粉38.54 g/L、尿素4.57 g/L、结晶乙酸钠8.51 g/L、磷酸氢二钾3.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、无水硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.06 g/L 、吐温-80 1.0 g/L。经优化试验验证可得，优化培养基的最大发酵活菌数达到1.533×1010 CFU/mL，是相同条件下MRS培养基中发酵活菌数的14.6倍。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料2
1.1.1 供试菌株2
1.1.2 主要试验试剂2
1.1.3 主要试验设备2
1.1.4 培养基2
1.2 试验方法2
1.2.1 种子液的制备2
1.2.2 发酵培养2
1.2.3 活菌数的测定2
1.2.4 生长曲线的测定3
1.2.5 最适碳源的优化3
1.2.6 最适氮源的优化3
1.2.7 最适pH的优化3
1.2.8 Plackett－Burman试验3
1.2.9 最陡爬坡试验3
1.2.10 响应曲面试验3
2 结果与分析3
2.1 生长曲线的测定3
2.2 最适碳源的优化4
2.3 最适氮源的优化4
2.4 最适pH的优化4
2.5 Plackett－Burman试验设计及筛选显著因子5
2.6 最陡爬坡试验6< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
br /> 2.7 BoxBehnken试验与响应面分析6
2.8 优化结果验证10
3 讨论10
致谢11
参考文献11
一株猪源粪肠球菌发酵培养基的优化
金善宝实验班(动物生产类) 王灯
引言
抗生素在畜禽养殖中长期且不合理地使用带来了药物残留，耐药菌株不断产生[1]。在杀灭病原菌的同时，抗生素也会影响有益菌的正常生长[2]。肠道微生物群是影响畜禽肠道健康的重要因素，在动物宿主的健康和营养消化等方面发挥着及其重要的作用[3]。长期或不合理地使用抗生素会破坏动物肠道的微生态平衡，降低其先天免疫力，造成肠道菌群失调，甚至引起畜禽内源性感染或二重感染[2,4]。微生态制剂是一类通过调节动物胃肠道微生态平衡，以达到预防疾病、促进动物生长、提高机体代谢和提高饲料吸收转化率的活的益生菌﹑其代谢产物以及其他物质，包括益生素、益生元、合生元等[5,6]。微生态制剂不仅能抑制致病菌的生长繁殖，而且无毒、无耐药性，是抗生素的有效替代品之一[7,8]。
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是属于肠球菌属的一种兼性厌氧型乳酸菌，常呈单个或短链状排列[9]。作为动物肠道内的主要菌群之一，粪肠球菌能够产生抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌生长的细菌素，改善肠道微环境[10]；同时，粪肠球菌能够降低肠道尿素酶与内毒素的含量，改善动物机体血液环境[11]；此外，粪肠球菌能够提升动物对钙质的吸收能力[12]。
目录
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 此株粪肠球菌是本实验室分离自健康仔猪肠道黏膜，经16sRNA
鉴定为粪肠球菌。
1.1.2 主要试验试剂 蛋白胨、酵母浸粉（北京双旋微生物培养基制品厂），牛肉浸
粉（青岛高科园海博生物技术有限公司），葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、脲（尿
素）、氯化钠、结晶乙酸钠、无水硫酸镁、硫酸锰、硝酸钠（天津巴斯夫化工有限公司），
吐温80（天津富宇精细化工有限公司），麦芽糖糊精（上海麦克林生化科技有限公司），
麦芽糖、低聚异麦芽糖、果糖、鱼蛋白胨、玉米粉、玉米浆干粉（上海瑞永生物科技有
限公司），柠檬酸氢二铵、硫酸铵、磷酸氢二钾（国药集团化学试剂有限公司）。
1.1.3 主要试验设备 台式恒温振荡器KYC100B（上海福玛实验设备有限公司），隔水式恒温培养箱GNP9270（上海精宏实验设备有限公司），电子分析天平SL302N（上海民桥精密科学仪器有限公司），旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），pH计 FE20(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司)，细菌浊度计WGZ2XJ（上海昕瑞仪器仪表有限公司），立式压力蒸汽灭菌器YXQLS50SII（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），超净工作台SWCJ1D（苏州净化设备有限公司）。
1.1.4 培养基 MRS液体培养基 (g/L)：蛋白胨 10.0，牛肉浸粉 5.0，酵母浸粉 4.0，葡萄糖 20.0，柠檬酸氢二铵 2.0，结晶乙酸钠 5.0，磷酸氢二钾 2.0，无水硫酸镁 0.2，硫酸锰0.04，吐温80 1.0，115℃灭菌30 min；配制固体时，在MRS液体培养基基础上加入 14 g/L 琼脂，同样条件下灭菌。
1.2 试验方法
1.2.1 种子液的制备 取适量保藏菌冻干粉于100 uL生理盐水溶解，接种环挑一环菌液于固体MRS培养基三区平板划线，于37 ℃培养箱静置培养24h。接种环挑一环菌苔接于装有150 mL液体MRS培养基的250 mL 锥形瓶中，37 ℃、120 r/min于恒温振荡器培养12h作种子液。
1.2.2 发酵培养 将种子液以1% (v/v)的接种量接于装有150mL 不同受试培养基的250mL 锥形瓶中，37 ℃、120 r/min 培养14 h，于培养结束时测定活菌数。每种样品做 3 组平行试验进行重复以减少实验误差。
1.2.3 活菌数的测定 培养结束时，取100 uL菌液于1mL生理盐水进行倍比稀释，取稀释度为105、106、107、108的菌液100uL均匀涂布MRS固体培养基，于37 ℃培养箱静置培养24h，对平板进行菌落计数，选择菌落数在50到300个的平板为准。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料2
1.1.1 供试菌株2
1.1.2 主要试验试剂2
1.1.3 主要试验设备2
1.1.4 培养基2
1.2 试验方法2
1.2.1 种子液的制备2
1.2.2 发酵培养2
1.2.3 活菌数的测定2
1.2.4 生长曲线的测定3
1.2.5 最适碳源的优化3
1.2.6 最适氮源的优化3
1.2.7 最适pH的优化3
1.2.8 Plackett－Burman试验3
1.2.9 最陡爬坡试验3
1.2.10 响应曲面试验3
2 结果与分析3
2.1 生长曲线的测定3
2.2 最适碳源的优化4
2.3 最适氮源的优化4
2.4 最适pH的优化4
2.5 Plackett－Burman试验设计及筛选显著因子5
2.6 最陡爬坡试验6< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
br /> 2.7 BoxBehnken试验与响应面分析6
2.8 优化结果验证10
3 讨论10
致谢11
参考文献11
一株猪源粪肠球菌发酵培养基的优化
金善宝实验班(动物生产类) 王灯
引言
抗生素在畜禽养殖中长期且不合理地使用带来了药物残留，耐药菌株不断产生[1]。在杀灭病原菌的同时，抗生素也会影响有益菌的正常生长[2]。肠道微生物群是影响畜禽肠道健康的重要因素，在动物宿主的健康和营养消化等方面发挥着及其重要的作用[3]。长期或不合理地使用抗生素会破坏动物肠道的微生态平衡，降低其先天免疫力，造成肠道菌群失调，甚至引起畜禽内源性感染或二重感染[2,4]。微生态制剂是一类通过调节动物胃肠道微生态平衡，以达到预防疾病、促进动物生长、提高机体代谢和提高饲料吸收转化率的活的益生菌﹑其代谢产物以及其他物质，包括益生素、益生元、合生元等[5,6]。微生态制剂不仅能抑制致病菌的生长繁殖，而且无毒、无耐药性，是抗生素的有效替代品之一[7,8]。
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是属于肠球菌属的一种兼性厌氧型乳酸菌，常呈单个或短链状排列[9]。作为动物肠道内的主要菌群之一，粪肠球菌能够产生抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌生长的细菌素，改善肠道微环境[10]；同时，粪肠球菌能够降低肠道尿素酶与内毒素的含量，改善动物机体血液环境[11]；此外，粪肠球菌能够提升动物对钙质的吸收能力[12]。
目录
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 此株粪肠球菌是本实验室分离自健康仔猪肠道黏膜，经16sRNA
鉴定为粪肠球菌。
1.1.2 主要试验试剂 蛋白胨、酵母浸粉（北京双旋微生物培养基制品厂），牛肉浸
粉（青岛高科园海博生物技术有限公司），葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、脲（尿
素）、氯化钠、结晶乙酸钠、无水硫酸镁、硫酸锰、硝酸钠（天津巴斯夫化工有限公司），
吐温80（天津富宇精细化工有限公司），麦芽糖糊精（上海麦克林生化科技有限公司），
麦芽糖、低聚异麦芽糖、果糖、鱼蛋白胨、玉米粉、玉米浆干粉（上海瑞永生物科技有
限公司），柠檬酸氢二铵、硫酸铵、磷酸氢二钾（国药集团化学试剂有限公司）。
1.1.3 主要试验设备 台式恒温振荡器KYC100B（上海福玛实验设备有限公司），隔水式恒温培养箱GNP9270（上海精宏实验设备有限公司），电子分析天平SL302N（上海民桥精密科学仪器有限公司），旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），pH计 FE20(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司)，细菌浊度计WGZ2XJ（上海昕瑞仪器仪表有限公司），立式压力蒸汽灭菌器YXQLS50SII（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），超净工作台SWCJ1D（苏州净化设备有限公司）。
1.1.4 培养基 MRS液体培养基 (g/L)：蛋白胨 10.0，牛肉浸粉 5.0，酵母浸粉 4.0，葡萄糖 20.0，柠檬酸氢二铵 2.0，结晶乙酸钠 5.0，磷酸氢二钾 2.0，无水硫酸镁 0.2，硫酸锰0.04，吐温80 1.0，115℃灭菌30 min；配制固体时，在MRS液体培养基基础上加入 14 g/L 琼脂，同样条件下灭菌。
1.2 试验方法
1.2.1 种子液的制备 取适量保藏菌冻干粉于100 uL生理盐水溶解，接种环挑一环菌液于固体MRS培养基三区平板划线，于37 ℃培养箱静置培养24h。接种环挑一环菌苔接于装有150 mL液体MRS培养基的250 mL 锥形瓶中，37 ℃、120 r/min于恒温振荡器培养12h作种子液。
1.2.2 发酵培养 将种子液以1% (v/v)的接种量接于装有150mL 不同受试培养基的250mL 锥形瓶中，37 ℃、120 r/min 培养14 h，于培养结束时测定活菌数。每种样品做 3 组平行试验进行重复以减少实验误差。
1.2.3 活菌数的测定 培养结束时，取100 uL菌液于1mL生理盐水进行倍比稀释，取稀释度为105、106、107、108的菌液100uL均匀涂布MRS固体培养基，于37 ℃培养箱静置培养24h，对平板进行菌落计数，选择菌落数在50到300个的平板为准。
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