猪糖皮质激素受体在皮下肌内脂肪中dna甲基化分析
肌内脂肪的沉积影响猪肉品质。研究表明肌内脂肪与皮下脂肪的沉积机制存在差异。在提高肌内脂肪沉积的同时，不增加甚至减少皮下脂肪沉积，对于提高猪肉品质、降低经济浪费至关重要。糖皮质激素对脂肪沉积具有明显的促进作用，能够诱导前体脂肪细胞的增殖和分化，其作用的发挥需要通过糖皮质激素受体（GR）来介导。因此本课题比较皮下脂肪组织与肌内脂肪组织中GR的差异表达水平，然后通过生物信息学分析，了解GR的基因结构，构建启动子缺失报告载体，分析GR的启动子活性，并从甲基化表观调控水平上寻找GR在两种组织中的表达差异机制，为肌内脂肪沉积的特异性调控提供理论依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1实验材料与方法 2
1.1实验材料 2
1.1.1实验动物 2
1.1.2实验主要试剂 2
1.1.3主要仪器 2
1.2实验方法 3
1.2.1组织DNA提取 3
1.2.2 DNA质量鉴定 3
1.2.3猪GR基因启动子区CpG岛分析 3
1.2.4引物设计 3
1.2.5 亚硫酸盐处理 3
1.2.6 PCR扩增检测 4
1.2.7凝胶回收步骤 4
1.2.8酶切 4
1.2.9连接T载体 5
1.2.10转化感受态 5
1.2.11涂板 5
1.2.12菌液PCR测序 5
2结果与分析 5
2.1 GR基因在皮下脂肪与肌内脂肪中的表达水平 5
2.2 GR启动子的CpG岛预测 6
2.3 Promoter 1C和1H的位置 6
2.4 Promoter 1C和1H在脂肪中的甲基化水平分析 7
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 10
猪糖皮质激素受体在皮下、肌内脂肪中的DNA甲基化分析
动物科学 赵肖飞
引言
引言
脂肪组织在不 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
同部位的分布以及沉积是影响胴体品质及肉质风味的关键，其中肌内脂肪和皮下脂肪主要影响猪的胴体品质，但是对肉质品质的贡献率不同[1]，肌内脂肪对肉质品质的影响大于皮下脂肪，皮下脂肪细胞的分化能力和聚脂能力高于肌内脂肪。猪的肌内脂肪含量是一个遗传力中等偏上的性状[2]。肌内脂肪含量与背膘厚存在中等程度的正相关，即背膘厚低（瘦肉型）的个体肌内脂肪含量总体偏低，背膘厚高（脂肪型）的个体肌内脂肪含量偏高，而这种正相关关系使我们在选育的过程中无法同时兼顾提高肌内脂肪与降低体脂含量（提高瘦肉率）两方面的要求。因此，了解不同部位脂肪的沉积机制，特异性调控肌内脂肪沉积对于提高猪胴体品质及肉质风味至关重要。
糖皮质激素（Glucocorticoid, GC）能促进脂肪细胞的增殖和分化，促进脂质沉积，其作用需要通过糖皮质激素受体（Glucocorticoid Reccptor, GR）介导。糖皮质激素受体是一种可溶性单链多肽组成的磷蛋白，它与GC具有高亲和力与专一性，是GC发挥重要生理和药理作用的中介物。GR是糖皮质激素的Ⅱ型受体，也是糖皮质激素效应的执行者。同时GR也是一种重要的核转录因子，对多种基因具有转录调控作用[3]。
DNA甲基化是哺乳动物基因表达调控的重要方式之一，这种修饰不改变基因的序列，但它参与机体多种生物学过程的调控，如基因转录抑制、细胞分化和发育调控。近年来研究表明，甲基化有高度组织特异性[4]，并且DNA甲基化与脂肪沉积有关[5]。
GR基因的启动子区甲基化水平的研究还未见报道，本课题主要通过实时定量PCR技术分析肌内脂肪与皮下脂肪中GR基因表达的差异，并通过启动子区甲基化分析来研究GR基因在肌内与皮下脂肪组织中差异表达的机制。
1实验材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
本研究实验动物来自二花脸商品猪，将其颈动脉放血屠宰后，立即取背最长肌肌肉与其周围皮下脂肪组织，组织离体后立即放入液氮罐保存。在实验室进行肌内脂肪含量测定。挑选体重约80kg商品猪10头，并对肌内脂肪进行手术分离，即使用眼科镊在冰上分离肌肉中的脂肪，进行以下实验。
1.1.2实验主要试剂
Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇、BSP试剂盒、T载体、DH5α感受态细胞、LB（含氨苄）培养基。
1.1.3主要仪器
低温高速离心机、移液枪
立式压力蒸汽灭菌器
紫外分光光度计
荧光定量PCR仪
PCR仪
水浴锅
隔水式恒温培养箱
气浴恒温振荡器
显微镜
细胞培养箱
超净台
凝胶成像系统
电子天平
1.2实验方法
1.2.1组织DNA提取
手术法分离肌肉中的脂肪组织，提取肌内脂肪以及皮下脂肪组织的DNA，具体方法如下：
1）将脂肪组织液氮速冻碾碎，置于2ml离心管中。
2）加入900ml裂解液，及30μl蛋白酶K，摇匀。
3）置于55℃水浴锅孵育过夜（加封口膜防水），直至管中无组织样液体清亮。
4）每管加入等体积（900μl）饱和酚，摇匀器上室温摇匀15分钟，10000转/分4℃离心1015分钟。
5）取上清，置于新的2ml离心管中，加500μl饱和酚，500μl氯仿（氯仿：异戊醇=24:1），室温混摇15分钟，10000转/分4℃离心1015分钟。
6）取上清，置于新的2ml离心管中，加等体积的纯氯仿，室温混摇15分钟，10000转/分4℃离心1015分钟。
7）取上清，置于1.5ml离心管中，加入800μl无水乙醇，室温混摇15分钟，10000转/分4℃离心1015分钟。
8）弃上清，加入1ml 70%的乙醇洗涤，10000转/分4℃离心1015分钟。
9）重复步骤8
10)空离2分钟，吸干剩余乙醇，通风处内风干，加灭菌水溶解（提前55℃预热），20℃保存。
1.2.2 DNA质量鉴定
利用紫外分光光度计测定DNA样品质量，要求OD260/OD280以及OD260/OD230比值均在2.0左右，表明DNA没有蛋白质及有机试剂污染。测定完成，20℃可长期保存。
1.2.3猪GR基因启动子区CpG岛分析
从NCBI数据库（或Ensembl）获得GR基因启动子区序列。使用以下网站预测GR外显子Exon 1C、1H的特异性启动子Promoter 1C、1H近端启动子区的CpG岛：
利用Promoter Scan和Promoter 2.0 Prediction Server（http://www.cbs.dtu.dk/
services/Promoter/）对GR进行启动子预测。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1实验材料与方法 2
1.1实验材料 2
1.1.1实验动物 2
1.1.2实验主要试剂 2
1.1.3主要仪器 2
1.2实验方法 3
1.2.1组织DNA提取 3
1.2.2 DNA质量鉴定 3
1.2.3猪GR基因启动子区CpG岛分析 3
1.2.4引物设计 3
1.2.5 亚硫酸盐处理 3
1.2.6 PCR扩增检测 4
1.2.7凝胶回收步骤 4
1.2.8酶切 4
1.2.9连接T载体 5
1.2.10转化感受态 5
1.2.11涂板 5
1.2.12菌液PCR测序 5
2结果与分析 5
2.1 GR基因在皮下脂肪与肌内脂肪中的表达水平 5
2.2 GR启动子的CpG岛预测 6
2.3 Promoter 1C和1H的位置 6
2.4 Promoter 1C和1H在脂肪中的甲基化水平分析 7
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 10
猪糖皮质激素受体在皮下、肌内脂肪中的DNA甲基化分析
动物科学 赵肖飞
引言
引言
脂肪组织在不 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
同部位的分布以及沉积是影响胴体品质及肉质风味的关键，其中肌内脂肪和皮下脂肪主要影响猪的胴体品质，但是对肉质品质的贡献率不同[1]，肌内脂肪对肉质品质的影响大于皮下脂肪，皮下脂肪细胞的分化能力和聚脂能力高于肌内脂肪。猪的肌内脂肪含量是一个遗传力中等偏上的性状[2]。肌内脂肪含量与背膘厚存在中等程度的正相关，即背膘厚低（瘦肉型）的个体肌内脂肪含量总体偏低，背膘厚高（脂肪型）的个体肌内脂肪含量偏高，而这种正相关关系使我们在选育的过程中无法同时兼顾提高肌内脂肪与降低体脂含量（提高瘦肉率）两方面的要求。因此，了解不同部位脂肪的沉积机制，特异性调控肌内脂肪沉积对于提高猪胴体品质及肉质风味至关重要。
糖皮质激素（Glucocorticoid, GC）能促进脂肪细胞的增殖和分化，促进脂质沉积，其作用需要通过糖皮质激素受体（Glucocorticoid Reccptor, GR）介导。糖皮质激素受体是一种可溶性单链多肽组成的磷蛋白，它与GC具有高亲和力与专一性，是GC发挥重要生理和药理作用的中介物。GR是糖皮质激素的Ⅱ型受体，也是糖皮质激素效应的执行者。同时GR也是一种重要的核转录因子，对多种基因具有转录调控作用[3]。
DNA甲基化是哺乳动物基因表达调控的重要方式之一，这种修饰不改变基因的序列，但它参与机体多种生物学过程的调控，如基因转录抑制、细胞分化和发育调控。近年来研究表明，甲基化有高度组织特异性[4]，并且DNA甲基化与脂肪沉积有关[5]。
GR基因的启动子区甲基化水平的研究还未见报道，本课题主要通过实时定量PCR技术分析肌内脂肪与皮下脂肪中GR基因表达的差异，并通过启动子区甲基化分析来研究GR基因在肌内与皮下脂肪组织中差异表达的机制。
1实验材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
本研究实验动物来自二花脸商品猪，将其颈动脉放血屠宰后，立即取背最长肌肌肉与其周围皮下脂肪组织，组织离体后立即放入液氮罐保存。在实验室进行肌内脂肪含量测定。挑选体重约80kg商品猪10头，并对肌内脂肪进行手术分离，即使用眼科镊在冰上分离肌肉中的脂肪，进行以下实验。
1.1.2实验主要试剂
Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇、BSP试剂盒、T载体、DH5α感受态细胞、LB（含氨苄）培养基。
1.1.3主要仪器
低温高速离心机、移液枪
立式压力蒸汽灭菌器
紫外分光光度计
荧光定量PCR仪
PCR仪
水浴锅
隔水式恒温培养箱
气浴恒温振荡器
显微镜
细胞培养箱
超净台
凝胶成像系统
电子天平
1.2实验方法
1.2.1组织DNA提取
手术法分离肌肉中的脂肪组织，提取肌内脂肪以及皮下脂肪组织的DNA，具体方法如下：
1）将脂肪组织液氮速冻碾碎，置于2ml离心管中。
2）加入900ml裂解液，及30μl蛋白酶K，摇匀。
3）置于55℃水浴锅孵育过夜（加封口膜防水），直至管中无组织样液体清亮。
4）每管加入等体积（900μl）饱和酚，摇匀器上室温摇匀15分钟，10000转/分4℃离心1015分钟。
5）取上清，置于新的2ml离心管中，加500μl饱和酚，500μl氯仿（氯仿：异戊醇=24:1），室温混摇15分钟，10000转/分4℃离心1015分钟。
6）取上清，置于新的2ml离心管中，加等体积的纯氯仿，室温混摇15分钟，10000转/分4℃离心1015分钟。
7）取上清，置于1.5ml离心管中，加入800μl无水乙醇，室温混摇15分钟，10000转/分4℃离心1015分钟。
8）弃上清，加入1ml 70%的乙醇洗涤，10000转/分4℃离心1015分钟。
9）重复步骤8
10)空离2分钟，吸干剩余乙醇，通风处内风干，加灭菌水溶解（提前55℃预热），20℃保存。
1.2.2 DNA质量鉴定
利用紫外分光光度计测定DNA样品质量，要求OD260/OD280以及OD260/OD230比值均在2.0左右，表明DNA没有蛋白质及有机试剂污染。测定完成，20℃可长期保存。
1.2.3猪GR基因启动子区CpG岛分析
从NCBI数据库（或Ensembl）获得GR基因启动子区序列。使用以下网站预测GR外显子Exon 1C、1H的特异性启动子Promoter 1C、1H近端启动子区的CpG岛：
利用Promoter Scan和Promoter 2.0 Prediction Server（http://www.cbs.dtu.dk/
services/Promoter/）对GR进行启动子预测。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/715.html
