猪不同代谢类型骨骼肌差异表达的环形rna的筛选及其功能分析(附件)
环状RNA（circular RNA，circRNA）是一种闭合的环状RNA，不易被RNA酶降解，在哺乳动物间保守性高。研究发现circRNA参与肌细胞的分化和肌肉的发育调控，然而，其在不同肌纤维类型骨骼肌的表达差异和生理功能尚不清楚。本研究分析了猪骨骼肌高通量测序预测所得的circRNAs数据库，通过比对和PCR验证其真实性，并对猪背最长肌和腰大肌circRNA进行了定量分析，通过生物信息学预测了其结合的microRNA的功能，从而初步探讨了circRNA在不同类型肌肉中的生理学功能。关键字环状RNA；猪；骨骼肌；肌纤维类型Screening and Functional Analysis of Differentially Expressed Circular RNAs in Skeletal Muscles of Pigs with Different Metabolic TypesChen qihao, a student majoring in animal medicine.Instructor Jia yimin.Abstract: Circular RNA (circular RNA) is a closed circular RNA that is not easily degraded by RNase and is highly conserved among mammals. Studies have found that circRNA is involved in the differentiation of muscle cells and the regulation of muscle development. However, its expression and physiological functions in skeletal muscles of different muscle fiber types are not yet clear. In this study, the circRNAs database predicted by high-throughput sequencing of porcine skeletal muscles was analyzed and verified for authent *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
icity by blasting and PCR. Realtime PCR was used for quantitative analysis of circRNAs in the longissimus dorsi and psoas major muscle of pig, also bioinformatics was applied to predict the function of microRNA binding on the cirRNA, thus preliminary exploration of the physiological function of circular RNA in different types of muscles. Thus, we preliminary investigated the physiologic function of circRNA in different types of muscles.骨骼肌主要由肌纤维构成。肌纤维的细胞形态、收缩方式以及代谢特点决定了肌纤维的类型[1]。肌纤维可分为4个亚型，即慢速氧化型肌纤维（MyHC-Ⅰ型）、快速氧化型（MyHC-Ⅱa型）、快速酵解型（MyHC-Ⅱb型）和中间型（MyHC-Ⅱx型）[2]。Ⅱ型肌纤维与Ⅰ型肌纤维相比较，其血管分布较少，肌红蛋白和线粒体含量较低，但糖原含量很高。因此，II型肌纤维含量高的肌肉组织糖酵解潜力强，屠宰后pH值下降地更快。而低pH 能破坏肌细胞膜完整性，导致肌红蛋白和风味物质流失, 从而改变肉质性状[3]。此外，猪Ⅰ型和Ⅱa型肌纤维与肉的嫩度、肉色呈正相关，与肉的滴水损失成负相关；Ⅱb型肌纤维与肉的嫩度、肉色呈负相关。因此，Ⅱb型肌纤维数量越多，猪肉的品质越差[4-5]。由此可见，肌纤维类型是决定猪肉品质的关键内在因素，与肉质变化有着密不可分的联系[6]。CircRNA分子呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶RNaseR降解，具有高度保守性，其序列组成大多数来源于外显子[7-8]。随着分子医学的进步，越来越多的环状RNA研究成果在国内外出现，人们也更多的了解到环状RNA在肌肉发育中的作用。Guoming Liang等[8]全面分析了贵州小型猪9个器官和3个骨骼肌的环状RNA，鉴定了5,934个环状RNA，并分析了它们的分子特性、序列保存、表达模式、潜在功能以及与miRNAs的相互作用，构建了第一个猪环状RNA数据库[12]。在恒河猴的研究也表明，circRNA的表达随着年龄的增长，表现出很大的差异性。Salzman等[10]确定了149个可能与肌肉生长相关的环状RNA，发现它们与肌肉发育、收缩、染色质修饰、阳离子稳态和ATP水解-耦合质子转运密切相关。这些环状RNA可能通过circRNA-miRNA-mRNA网络互作机制发挥海绵作用。Jianning Chen等[11]研究了肌肉衰老模型下circRNA-miRNA-mRNA共表达网络，为研究肌肉衰老的分子机制提供基础。Xuefeng Wei等[12]研究发现circLMO7通过miR-378a-3p海绵机制参与调控牛成肌细胞的分化和凋亡。然而，circRNA在不同代谢类型骨骼肌中的表达差异情况及生理功能尚不清楚，揭示其作用机制可以为猪骨骼肌肌纤维类型的形成提供线索。1材料与方法1.1实验材料1.1．1仪器匀浆仪、离心机、超净台、移液枪、微量加样器、凝胶电泳、凝胶电泳成像仪、微量加样器、恒温水浴锅、PCR扩增仪、荧光定量PCR扩增仪、超净台、水浴锅、高压锅、37摄氏度温箱、旋涡混合器、双面离心管架、台式离心机1.1.2试剂RNA的提取准备试剂氯仿、异丙醇、75%乙醇、无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)RNA的纯度检测准备试剂琼脂糖、10× MOPS电泳缓冲液、37% 甲醛溶液(12.3 M) 、EBRT-PCR的试剂准备醋酸钠（pH 5.2），NaOH，1×上样缓冲液（20mM Tris-HCl (pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA；0.1%SLS，洗脱缓冲液（10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA (pH 8.0)），0.05% SDS，无水乙醇，70%乙醇，DEPCReal-Time PCR实验试剂SYBR Green 1 染料、上游引物、下游引物、dNTP、Taq聚合酶 、样品cDNA、ddH2O 。1.2试验方法1.2.1猪肉样本的采集与RNA提取（1）采集猪被最长肌和腰大肌样本，-80℃冰箱冻存。（2）将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。（3）每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。（4）将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。（5）移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPC水配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。（6）小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。（7）溶解RNA沉淀，溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1.2.2 RNA的纯度检测实验（变性琼脂糖凝胶电泳）（1）制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。表1 10×MOPS电泳缓冲液浓度（mol/L）成分0.4MOPS0.1乙酸钠0.01EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 ml溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。（2）取3gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 g/mL。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。（3）电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。（4）紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。拍下电泳结果。1.2.3RT-PCR实验表2 cDNA的制备体系DEPC H2O 8 μLdNTP2.5 μL上游引物0.2 μL下游引物0.2 μL样本RNA3 μLRnase核酸内切酶0.5 μL总体系20 μL轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。1.2.4 Real-Time PCR实验（1）所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。体系配置如下表3 Real-Time PCR反应体系含量成分5 μLSYBR Green 0.2 μL上游引物0.2 μL0.2 μL1 μL3.4 μL下游引物Rox待测样品cDNAddH2O轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。（2）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。下图为实验所用引物。表4 肌肉纤维分型引物基因引物MyHC-1R:GACATTCGAGAAACCAAGGCGF: TTGAGGTTGTAGAGCACCGCMyHC-2aMyHC-2xMyHC-2bR:CTCACTTGCTAAGAAGGACCTCTGF: CCTGCTTCCGTCTTCACTGTR: AGGGTCTTTGACTGGGCTF: CCTGCTTCCGTCTTCACTGTR:ACATAAGAGGTACATCTAGTGCCCF: TGGCCATGTCCTCGATCTTG1.2.5 circRNA功能验证实验（1）将RT-PCR产物与IDH2基因上下游引物作为反应体系，进行PCR扩增。（2）凝胶电泳后观察条带，验证产物长度与IDH2基因产物匹配后进行切胶回收。在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶,用纸巾吸净凝胶表面液体并切碎。计算 凝胶重量。该重量作为一个凝胶体积 (提前记录 1.5 mL 离心管重量, 100 mg 等于 100 μL 体 积)加入 3个凝胶体积的 Buffer DE-A,混合均匀后于 75℃加热 (低熔点琼脂糖凝胶于 40℃加 热) ,间断混匀(每 2-3 min ) ,直到凝胶块完全融化。 (约 6-8 min )加 0.5个 buffer DE-A体积的 Buffer DE-B,混匀。4.吸取 3中混合液,转移到 DNA 制备管中(2ml 试剂盒内提供的离心管)中, 12000g 离 心 1Min ,室温放置 2 min 。弃滤液。将制备管置于 2ml 离心管中, 加 500ul buffer W1, 放置 2 min , 12000g 离心 30s 弃滤液。将制备管置于 2ml 离心管中, 加 700ul buffer W2, 放置 2Min , 12000g 离心 30s 弃滤液。 重复一次,不过时间为 1 min 。将制备管置于 2ml 离心管中, 12000g 再离心 1 min。将制备管置于洁净的 1.5ml 的离心管中(试剂盒内提供) ,在制备膜中央加入 25-30 μL Eluent ,室温静置 1min , 12000g 离心 1min 洗脱 DNA. 可暂放 -20冰箱中。（3）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 μL。 表5 转接质粒体系试剂使用量pMD19-T Vector1μlddH2O3μlControl Insert1μl加入 5 μl（等量）的 Solution I，16℃反应 30 分钟。全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。在含有Amp 的 LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落，37℃培养16h。（4）菌液送检测序，验证基因序列无误后，利用重叠PCR技术进行质粒扩增。2结果与分析2.1猪肉样本RNA纯度检测结果RNA可以使用变性凝胶电泳进行检测。在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。在此次变性凝胶电泳图谱中，可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，证明了RNA样本的完整性。图1 RNA完整性验证2.2猪不同肌肉中肌球蛋白重链基因表达图2 二花脸猪背最长肌和腰大肌肌纤维类型基因表达数据是平均值±标准误。*表示差异显著， **表示差异极显著， #表示有变化趋势；LM，longissimus dorsi muscle；PM，psoas muscle； MyCH， myosin heavy chain。Real-timePCR结果分析发现，腰大肌的MyCHⅠ型（p<0.01）肌纤维显著高于背最长肌，MyCHⅡb型（p<0.01）肌纤维显著低于背最长肌。2.3特异性高表达circRNA序列选择及验证结果在NCBI网站上下载猪肌肉中高表达的所有基因序列以及猪所有预测的circRNA序列，进行比对和筛选，最终确定了可能的circRNA序列（附录1），确定并利用primer5软件设计了背靠背引物，切口与引物的选择确定（附录2）合成引物后，进行PCR扩增,检测是否有circRNA合成。（如果预测的circRNA是线性的，无法得到扩增产物）最终确定在猪肌肉存在的环状RNA。下图是circRNA的线性基因的胶图和溶解曲线。图3 circRNA的PCR产物溶解度曲线图4circRNA的PCR产物凝胶电泳图2.4目的circRNA的验证利用real-time PCR验证67种目的基因在二花脸猪腰大肌和腹背最长肌中的表达是否存在差异，最终发现仅有2种基因（IDH2与MRPS5）在不同肌肉中表达存在显著性差异，其余基因均不存在显著性差异。。图5存在差异的两种circRNA在不同肌肉中的表达数据是平均值±标准误。*表示差异显著， **表示差异极显著；LM，longissimus dorsi muscle；PM，psoas muscle；图6目的circRNA的溶解曲线及胶图图7目的circRNA的测序结果2.5 cirRNA-IDH2功能预测 通过mirnda和RNAhybrid分别预测出结合在circRNA的miRNA有15和210个，取两者的交集，并进行保守性分析。最终得到四个miRNAs，分别是miR-335、miR-149、miR-24和miR-100。利用PicTar软件分别预测出四个miRNAs的靶基因，分别对PicTar score值大于2的基因进行pathway分析。结果发现，只有miRNA有较大的潜力发挥生物学功能。表6 miR100预测靶基因reactome分析Pathway nameNO. of genepFDRHS-GAG biosynthesis20.000.09Heparan sulfate/heparin (HS-GAG) metabolism20.000.14Post-transcriptional silencing by small RNAs10.010.14Competing endogenous RNAs (ceRNAs) regulate PTEN translation10.010.14RNF mutants show enhanced WNT signaling and proliferation10.010.14VLDL clearance10.010.14Small interfering RNA (siRNA) biogenesis10.010.14Regulation of gene expression in endocrine-committed (NEUROG3+) progenitor cells10.010.14Glycosaminoglycan metabolism20.010.14TP53 Regulates Metabolic Genes20.010.14Adenylate cyclase activating pathway10.010.14Adenylate cyclase inhibitory pathway10.020.15Inhibition of adenylate cyclase pathway10.020.15PKA activation10.020.15NoRC negatively regulates rRNA expression20.020.15VLDLR internalisation and degradation10.020.15PKA activation in glucagon signalling10.020.15CREB phosphorylation through the activation of Adenylate Cyclase10.030.15cirRNA-IDH2功能有调控硫酸乙酰肝素、肝素(HS-GAG)新陈代谢，转录不表达的小RNA。翻译竞争内源性RNA(ceRNAs)调节PTEN,显示增强的WNT信号通路传导和扩散RNF突变体,清除极低密度脂蛋白，作为小干扰RNA (siRNA)生物起源。，作为内分泌的基因表达调控祖细胞，调控粘多糖代谢，调节TP53基因代谢，调节腺苷酸环激活通路，腺苷酸环化酶抑制通路，激活蛋白激酶 A，负调控一氧化氮还原酶对rRNA的表达，调控极低密度脂蛋白受体内化和退化，通过活化腺苷酸环化酶产生的环磷腺苷效应元件结合蛋白磷酸化等作用。3.讨论本研究分析了猪骨骼肌高通量测序预测所得的circRNAs数据库，通过比对和PCR验证其真实性，并对猪背最长肌和腰大肌circRNA进行了定量分析。但是在猪骨骼肌中含有的circRNA 可能会与高通量测序预测所得的circRNAs数据库存在差异，如果使用核糖核酸外切酶去除所有线性RNA分子，在进行测序会得到完整的circRNAs数据库，但由于时间和资源有限，本实验无法完成如此大量的测序结果。circRNA与肌肉发育、收缩、染色质修饰、阳离子稳态和ATP水解-耦合质子转运密切相关。这些环状RNA可能通过circRNA-miRNA-mRNA网络互作机制发挥海绵作用。也能够顺式或反式调控基因转录从而影响基因表达，能够与RNA聚合酶相互作用促进自身编码基因转录。在本次实验中并没有将构建的OE质粒进行动物实验，对于其可能对于肌肉细胞产生的肌球蛋白重链基因表达差异也仅停留在理论阶段。当然，虽然实验中还有许多值得改进的地方，但是在实验中我们通过比较发现猪腹背最长肌的Ⅱ型肌纤维明显高于腰大肌，其肉质也较差，同时也得到了IDH2基因的circRNA在腰大肌中的表达远高于腹背最长肌，由于本实验采集的样本是来自年龄性别体重饲养条件几乎无差异的六只二花脸猪，因此可以推导出猪不同类型的骨骼肌的差异源于环状RNA的表达差异，由此可以认为如果能提高circRNA在肌纤维细胞中的表达量或含量，就有可能显著性的提高猪肉的肉质。为猪肉生产研究提供新的方向。通过一些对于circRNA的深入研究我们发现其形成过程受到剪接因子的调控，且多数具有序列保守性表达水平差异大，具有时空特异性及组织细胞特异性。如果能通过特异性的剪切因子帮助线性RNA形成环状RNA，将成为内源性药物来提高基因的表达水平来提进一步提高猪肉的品质，这无疑是为猪肉生产研究提供新的方向。致谢写作毕业论文是一次再系统学习的过程，毕业论文的完成，同时意味着新的学习工作的开始。我将铭记我是一名南农学子，在今后的工作中把南农的优良传统发扬光大。感谢各位专家的批评指导。参考文献[1] 任列娇, 赵素梅, 高士争. 乌金猪肌肉组织肌纤维类型分析[C]// 全国动物生理生化第十一次学术交流会论文汇编. 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Cell Death & Disease, 2017, 8(10):e3153.附录1 预测CircRNA 的基因位点IDLocationStrandExonsCircRNA lengthGene symbolssc-ciR-00071chrX:106978781-106988101-2312AMOTssc-ciR-00080chrX:115991641-116006863-5320THOC2ssc-ciR-00081chrX:116341277-116352321-9735STAG2ssc-ciR-00097chrX:130750806-130763718-71229ATP11Cssc-ciR-00282chr1:110525007-110548336+2698MADH4ssc-ciR-00285chr1:114019115-114019268-4485MBD2ssc-ciR-00320chr1:127997792-128040020+3299TEX9ssc-ciR-00343chr1:134782800-134790152-6821USP8ssc-ciR-00373chr1:144984557-145007808-3805RTF1ssc-ciR-00678chr2:2992757-3002697+3229PPP6R3ssc-ciR-00784chr2:52168906-52169771-3348MRVI1ssc-ciR-00799chr2:61870481-61872040+6797BRD4ssc-ciR-00895chr2:91206106-91230855+2221MSH3ssc-ciR-00905chr2:98306663-98326796+3311TMEM161Bssc-ciR-00923chr2:120022509-120028042+6565SLC25A46ssc-ciR-00968chr2:142477139-142478346-5507SAR1Bssc-ciR-01485chr4:55329544-55333311-3292WWP1ssc-ciR-01553chr4:85304080-85367540+141910PCMTD1ssc-ciR-01727chr4:139855413-139864288-3693PKN2ssc-ciR-01866chr5:68122726-68128063-3260C12orf4ssc-ciR-02610chr6:42900790-42902755+2273RYR1ssc-ciR-02611chr6:42948946-42949075+2144RYR1ssc-ciR-02648chr6:54305292-54306169-3945TNNT1;ssc-ciR-02668chr6:64542086-64545302-5702KIF1Bssc-ciR-02676chr6:69151419-69154853+3368DDI2ssc-ciR-02722chr6:85062797-85065591+1132ZMYM4ssc-ciR-02767chr6:99220824-99317549-5547ESCO1ssc-ciR-02801chr6:108625882-108627548-3307RNF138ssc-ciR-02816chr6:125570379-125576069-3340NEXNssc-ciR-02832chr6:137844859-137861689-5577ATG4Cssc-ciR-02976chr7:35673692-35676214-2235ANKS1Assc-ciR-03005chr7:57608749-57609962+6860WHAMMssc-ciR-03014chr7:60544560-60546813-171338IDH2;ssc-ciR-03096chr7:91976024-91982115-2153CHD2ssc-ciR-03113chr7:100085511-100087357-3574SLC8A3ssc-ciR-03305chr8:74821696-74824447-??MTHFD2Lssc-ciR-03308chr8:75774298-75779107-??SDAD1ssc-ciR-03349chr8:93154226-93168617-??SETD7ssc-ciR-03551chr9:29740806-29743556-1153CEP295ssc-ciR-03595chr9:44292299-44293899+??PPP2R1Bssc-ciR-03688chr9:108522657-108524946-1101CACNA2D1ssc-ciR-03761chr9:138073301-138107955-??C1orf21ssc-ciR-03907chr10:46681559-46779066-??ZEB1ssc-ciR-04310chr12:47804288-47833910-5795SSH2ssc-ciR-04329chr12:53698947-53721538-5670RABEP1ssc-ciR-04427chr13:22823028-22825406-114853ARPP21ssc-ciR-04429chr13:23758062-23758266-52530LRRFIP2ssc-ciR-04435chr13:25467655-25487285-74430EXOGssc-ciR-04807chr13:210047703-210050422+222285MORC3ssc-ciR-04917chr14:37533454-37534498+5840FBXO21ssc-ciR-04937chr14:44169276-44175988-375934ACACBssc-ciR-04966chr14:53342470-53344161+??SMARCB1ssc-ciR-04998chr14:60127643-60145000-3383ARID4Bssc-ciR-05012chr14:65238370-65238710-??ACTA1;ssc-ciR-05036chr14:77540654-77542707-2185HNRNPH3ssc-ciR-05170chr14:146703125-146704738-05963EDRF1ssc-ciR-05470chr15:117585543-117585738-3382BMPR2ssc-ciR-05552chr15:156994989-156997659-??NEBssc-ciR-05737chr17:42215076-42215249+2322CHMP4Bssc-ciR-05763chr17:49153502-49171103+5588TOP1ssc-ciR-05799chr18:1457167-1463300+1478DNAJB6ssc-ciR-05854chr18:14764050-14766324+2321CNOT4ssc-ciR-05887chr18:27477940-27488803-3315CPED1附录2 CircRNA 缺口位置及引物基因引物缺口位置ACACBF: CTGCTTGCAGGAAGACCTCAACCCAA GTGGGCA R: TGTTGGCGGCAAGGTAGATTAGLF: GCCCACAGATAGACCGGAACATGAAG GCAAAAR: GGAGAATTCCAACGGCGACTATG4C F: GGTGATTCCCCCTTGACTCTCTGTAAG AACAAAR: TCCAAGCAATAACACAGGGGAATRX F: TTGCTGAAAGGGAGCGTGAGAGAGAG GAGATGR: GCCTATGTCTGTATCTCGGCTTCTSLF: TTTGGTGGTTGGCTATGGCTGAACAG GAAACAR: AGATGAATGGCCCGCATCAADDI2F: TAATGAGGCTGGTGGATCGTCATCTAG GCAACAGR: AAAGGCTTTCACAGGATGTCCADEKF: GCCAGGAAAGCTAAGCGAACGAGGAG AAAAGAR: GACACTGTGCCTGGTCTGTTDNAJB6F: AGAAGGATTGAACGGTGGCATCTTCG GGACTGR: TGTCTCTGCACGCCTAGAACEDRF1F: AAAACACTCTCTGGGGCTCTTGACCAG GTTGGTR: TCTAAGCAGTTCACACGGAGCEMC21F: TGAAATATGCTAGTTGGGCAGCTATCAG GCTGCAR: GCAAGTTCATGCCAGGCTTCFCHO2F: TTTGCACCAGTGTGGGATGTGAAAAG GGGGAAR: TGTCATTGACCTGGAGTATGCCHADHF: GATTTGCCGGGCTCCATTTCTGCAAG GTTGCTR: TACCAACACTACCGTGTGGCHNRNPH3F: AATGCGACGAGGAGGTGATGGAAGAG CATTTAR: TGGCACGATTTCCAACCCTTHOMERF: AGTAGCCAAGCAAATGCAGTGCTACAG TTCAGCR: AGCCTCCCAATGTTTGCTGAHSPA4F: CTGAAGGAGACGGCAGAAAGTGTTTCG GGCTTGR: 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1485F:TCTACAGACATTGTTGAGTTCTGACAAATAT CAATACR: AGAGGTGGGTCTAAGGTGTTGCircRNA - 14913F:AGAGGGGCTGATGGAGTTATGTTTAAT ACTTAAR: TGTCTGCCAACTGCGGGATACircRNA - 22612F:AGGAGAACCGACTGCGAATGATGAAG CTAGAGR: TGCAATTTCCTGCTCCCTCTCircRNA - 25738-F:CCCAGTTGGACAATGGAGTCATCCAAG ATCTAGR: GTGCTATTTCATAGTGGTCTGGGCircRNA - 27966F:TGTCAAGAAGACTGCCCACGGGACAA TTGAGGR: CCTTCACTGTGCGATGTTGCCircRNA - 3218R: AGATCAGCGACCCAGACCTTTAGCAA GCAGGTF:CCCAAATCTCAGGCGGGATGCircRNA - 6757F: GTCTGTTGGAGCATCTGGTCAACATAG TTGGTG R: CTGCATTCTTGGCGGCATAC
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.1.1仪器 2
1.1.2试剂 2
1.2试验方法 2
1.2.1猪肉样本的采集与RNA提取3
1.2.2 RNA的纯度检测实验 3
1.2.3 RTPCR进行逆转录及产物测序4
1.2.4 RealTime PCR比较不同代谢类型肌纤维骨骼肌的cirRNA表达水平 5
1.2.5 circRNA功能验证实验6
2结果与分析6
2.1猪肉样本RNA纯度6
2.2猪不同肌肉中肌球蛋白重链基因表达结果 7
2.3特异性高表达circRNA序列选择及验证结果 7
2.4目的circRNA的验证 8
2.5cirRNAIDH2功能预测10
3讨论 11
致谢 12
参考文献 12
附录1 猪所有预测可能的circRNA 14
附录2 67个circRNA切口与引物设计16
猪不同代谢类型骨骼肌差异表达的环形RNA的筛选及其
功能分析
引言
icity by blasting and PCR. Realtime PCR was used for quantitative analysis of circRNAs in the longissimus dorsi and psoas major muscle of pig, also bioinformatics was applied to predict the function of microRNA binding on the cirRNA, thus preliminary exploration of the physiological function of circular RNA in different types of muscles. Thus, we preliminary investigated the physiologic function of circRNA in different types of muscles.骨骼肌主要由肌纤维构成。肌纤维的细胞形态、收缩方式以及代谢特点决定了肌纤维的类型[1]。肌纤维可分为4个亚型，即慢速氧化型肌纤维（MyHC-Ⅰ型）、快速氧化型（MyHC-Ⅱa型）、快速酵解型（MyHC-Ⅱb型）和中间型（MyHC-Ⅱx型）[2]。Ⅱ型肌纤维与Ⅰ型肌纤维相比较，其血管分布较少，肌红蛋白和线粒体含量较低，但糖原含量很高。因此，II型肌纤维含量高的肌肉组织糖酵解潜力强，屠宰后pH值下降地更快。而低pH 能破坏肌细胞膜完整性，导致肌红蛋白和风味物质流失, 从而改变肉质性状[3]。此外，猪Ⅰ型和Ⅱa型肌纤维与肉的嫩度、肉色呈正相关，与肉的滴水损失成负相关；Ⅱb型肌纤维与肉的嫩度、肉色呈负相关。因此，Ⅱb型肌纤维数量越多，猪肉的品质越差[4-5]。由此可见，肌纤维类型是决定猪肉品质的关键内在因素，与肉质变化有着密不可分的联系[6]。CircRNA分子呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶RNaseR降解，具有高度保守性，其序列组成大多数来源于外显子[7-8]。随着分子医学的进步，越来越多的环状RNA研究成果在国内外出现，人们也更多的了解到环状RNA在肌肉发育中的作用。Guoming Liang等[8]全面分析了贵州小型猪9个器官和3个骨骼肌的环状RNA，鉴定了5,934个环状RNA，并分析了它们的分子特性、序列保存、表达模式、潜在功能以及与miRNAs的相互作用，构建了第一个猪环状RNA数据库[12]。在恒河猴的研究也表明，circRNA的表达随着年龄的增长，表现出很大的差异性。Salzman等[10]确定了149个可能与肌肉生长相关的环状RNA，发现它们与肌肉发育、收缩、染色质修饰、阳离子稳态和ATP水解-耦合质子转运密切相关。这些环状RNA可能通过circRNA-miRNA-mRNA网络互作机制发挥海绵作用。Jianning Chen等[11]研究了肌肉衰老模型下circRNA-miRNA-mRNA共表达网络，为研究肌肉衰老的分子机制提供基础。Xuefeng Wei等[12]研究发现circLMO7通过miR-378a-3p海绵机制参与调控牛成肌细胞的分化和凋亡。然而，circRNA在不同代谢类型骨骼肌中的表达差异情况及生理功能尚不清楚，揭示其作用机制可以为猪骨骼肌肌纤维类型的形成提供线索。1材料与方法1.1实验材料1.1．1仪器匀浆仪、离心机、超净台、移液枪、微量加样器、凝胶电泳、凝胶电泳成像仪、微量加样器、恒温水浴锅、PCR扩增仪、荧光定量PCR扩增仪、超净台、水浴锅、高压锅、37摄氏度温箱、旋涡混合器、双面离心管架、台式离心机1.1.2试剂RNA的提取准备试剂氯仿、异丙醇、75%乙醇、无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)RNA的纯度检测准备试剂琼脂糖、10× MOPS电泳缓冲液、37% 甲醛溶液(12.3 M) 、EBRT-PCR的试剂准备醋酸钠（pH 5.2），NaOH，1×上样缓冲液（20mM Tris-HCl (pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA；0.1%SLS，洗脱缓冲液（10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA (pH 8.0)），0.05% SDS，无水乙醇，70%乙醇，DEPCReal-Time PCR实验试剂SYBR Green 1 染料、上游引物、下游引物、dNTP、Taq聚合酶 、样品cDNA、ddH2O 。1.2试验方法1.2.1猪肉样本的采集与RNA提取（1）采集猪被最长肌和腰大肌样本，-80℃冰箱冻存。（2）将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。（3）每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。（4）将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。（5）移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPC水配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。（6）小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。（7）溶解RNA沉淀，溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1.2.2 RNA的纯度检测实验（变性琼脂糖凝胶电泳）（1）制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。表1 10×MOPS电泳缓冲液浓度（mol/L）成分0.4MOPS0.1乙酸钠0.01EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 ml溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。（2）取3gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 g/mL。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。（3）电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。（4）紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。拍下电泳结果。1.2.3RT-PCR实验表2 cDNA的制备体系DEPC H2O 8 μLdNTP2.5 μL上游引物0.2 μL下游引物0.2 μL样本RNA3 μLRnase核酸内切酶0.5 μL总体系20 μL轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。1.2.4 Real-Time PCR实验（1）所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。体系配置如下表3 Real-Time PCR反应体系含量成分5 μLSYBR Green 0.2 μL上游引物0.2 μL0.2 μL1 μL3.4 μL下游引物Rox待测样品cDNAddH2O轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。（2）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。下图为实验所用引物。表4 肌肉纤维分型引物基因引物MyHC-1R:GACATTCGAGAAACCAAGGCGF: TTGAGGTTGTAGAGCACCGCMyHC-2aMyHC-2xMyHC-2bR:CTCACTTGCTAAGAAGGACCTCTGF: CCTGCTTCCGTCTTCACTGTR: AGGGTCTTTGACTGGGCTF: CCTGCTTCCGTCTTCACTGTR:ACATAAGAGGTACATCTAGTGCCCF: TGGCCATGTCCTCGATCTTG1.2.5 circRNA功能验证实验（1）将RT-PCR产物与IDH2基因上下游引物作为反应体系，进行PCR扩增。（2）凝胶电泳后观察条带，验证产物长度与IDH2基因产物匹配后进行切胶回收。在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶,用纸巾吸净凝胶表面液体并切碎。计算 凝胶重量。该重量作为一个凝胶体积 (提前记录 1.5 mL 离心管重量, 100 mg 等于 100 μL 体 积)加入 3个凝胶体积的 Buffer DE-A,混合均匀后于 75℃加热 (低熔点琼脂糖凝胶于 40℃加 热) ,间断混匀(每 2-3 min ) ,直到凝胶块完全融化。 (约 6-8 min )加 0.5个 buffer DE-A体积的 Buffer DE-B,混匀。4.吸取 3中混合液,转移到 DNA 制备管中(2ml 试剂盒内提供的离心管)中, 12000g 离 心 1Min ,室温放置 2 min 。弃滤液。将制备管置于 2ml 离心管中, 加 500ul buffer W1, 放置 2 min , 12000g 离心 30s 弃滤液。将制备管置于 2ml 离心管中, 加 700ul buffer W2, 放置 2Min , 12000g 离心 30s 弃滤液。 重复一次,不过时间为 1 min 。将制备管置于 2ml 离心管中, 12000g 再离心 1 min。将制备管置于洁净的 1.5ml 的离心管中(试剂盒内提供) ,在制备膜中央加入 25-30 μL Eluent ,室温静置 1min , 12000g 离心 1min 洗脱 DNA. 可暂放 -20冰箱中。（3）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 μL。 表5 转接质粒体系试剂使用量pMD19-T Vector1μlddH2O3μlControl Insert1μl加入 5 μl（等量）的 Solution I，16℃反应 30 分钟。全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。在含有Amp 的 LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落，37℃培养16h。（4）菌液送检测序，验证基因序列无误后，利用重叠PCR技术进行质粒扩增。2结果与分析2.1猪肉样本RNA纯度检测结果RNA可以使用变性凝胶电泳进行检测。在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。在此次变性凝胶电泳图谱中，可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，证明了RNA样本的完整性。图1 RNA完整性验证2.2猪不同肌肉中肌球蛋白重链基因表达图2 二花脸猪背最长肌和腰大肌肌纤维类型基因表达数据是平均值±标准误。*表示差异显著， **表示差异极显著， #表示有变化趋势；LM，longissimus dorsi muscle；PM，psoas muscle； MyCH， myosin heavy chain。Real-timePCR结果分析发现，腰大肌的MyCHⅠ型（p<0.01）肌纤维显著高于背最长肌，MyCHⅡb型（p<0.01）肌纤维显著低于背最长肌。2.3特异性高表达circRNA序列选择及验证结果在NCBI网站上下载猪肌肉中高表达的所有基因序列以及猪所有预测的circRNA序列，进行比对和筛选，最终确定了可能的circRNA序列（附录1），确定并利用primer5软件设计了背靠背引物，切口与引物的选择确定（附录2）合成引物后，进行PCR扩增,检测是否有circRNA合成。（如果预测的circRNA是线性的，无法得到扩增产物）最终确定在猪肌肉存在的环状RNA。下图是circRNA的线性基因的胶图和溶解曲线。图3 circRNA的PCR产物溶解度曲线图4circRNA的PCR产物凝胶电泳图2.4目的circRNA的验证利用real-time PCR验证67种目的基因在二花脸猪腰大肌和腹背最长肌中的表达是否存在差异，最终发现仅有2种基因（IDH2与MRPS5）在不同肌肉中表达存在显著性差异，其余基因均不存在显著性差异。。图5存在差异的两种circRNA在不同肌肉中的表达数据是平均值±标准误。*表示差异显著， **表示差异极显著；LM，longissimus dorsi muscle；PM，psoas muscle；图6目的circRNA的溶解曲线及胶图图7目的circRNA的测序结果2.5 cirRNA-IDH2功能预测 通过mirnda和RNAhybrid分别预测出结合在circRNA的miRNA有15和210个，取两者的交集，并进行保守性分析。最终得到四个miRNAs，分别是miR-335、miR-149、miR-24和miR-100。利用PicTar软件分别预测出四个miRNAs的靶基因，分别对PicTar score值大于2的基因进行pathway分析。结果发现，只有miRNA有较大的潜力发挥生物学功能。表6 miR100预测靶基因reactome分析Pathway nameNO. of genepFDRHS-GAG biosynthesis20.000.09Heparan sulfate/heparin (HS-GAG) metabolism20.000.14Post-transcriptional silencing by small RNAs10.010.14Competing endogenous RNAs (ceRNAs) regulate PTEN translation10.010.14RNF mutants show enhanced WNT signaling and proliferation10.010.14VLDL clearance10.010.14Small interfering RNA (siRNA) biogenesis10.010.14Regulation of gene expression in endocrine-committed (NEUROG3+) progenitor cells10.010.14Glycosaminoglycan metabolism20.010.14TP53 Regulates Metabolic Genes20.010.14Adenylate cyclase activating pathway10.010.14Adenylate cyclase inhibitory pathway10.020.15Inhibition of adenylate cyclase pathway10.020.15PKA activation10.020.15NoRC negatively regulates rRNA expression20.020.15VLDLR internalisation and degradation10.020.15PKA activation in glucagon signalling10.020.15CREB phosphorylation through the activation of Adenylate Cyclase10.030.15cirRNA-IDH2功能有调控硫酸乙酰肝素、肝素(HS-GAG)新陈代谢，转录不表达的小RNA。翻译竞争内源性RNA(ceRNAs)调节PTEN,显示增强的WNT信号通路传导和扩散RNF突变体,清除极低密度脂蛋白，作为小干扰RNA (siRNA)生物起源。，作为内分泌的基因表达调控祖细胞，调控粘多糖代谢，调节TP53基因代谢，调节腺苷酸环激活通路，腺苷酸环化酶抑制通路，激活蛋白激酶 A，负调控一氧化氮还原酶对rRNA的表达，调控极低密度脂蛋白受体内化和退化，通过活化腺苷酸环化酶产生的环磷腺苷效应元件结合蛋白磷酸化等作用。3.讨论本研究分析了猪骨骼肌高通量测序预测所得的circRNAs数据库，通过比对和PCR验证其真实性，并对猪背最长肌和腰大肌circRNA进行了定量分析。但是在猪骨骼肌中含有的circRNA 可能会与高通量测序预测所得的circRNAs数据库存在差异，如果使用核糖核酸外切酶去除所有线性RNA分子，在进行测序会得到完整的circRNAs数据库，但由于时间和资源有限，本实验无法完成如此大量的测序结果。circRNA与肌肉发育、收缩、染色质修饰、阳离子稳态和ATP水解-耦合质子转运密切相关。这些环状RNA可能通过circRNA-miRNA-mRNA网络互作机制发挥海绵作用。也能够顺式或反式调控基因转录从而影响基因表达，能够与RNA聚合酶相互作用促进自身编码基因转录。在本次实验中并没有将构建的OE质粒进行动物实验，对于其可能对于肌肉细胞产生的肌球蛋白重链基因表达差异也仅停留在理论阶段。当然，虽然实验中还有许多值得改进的地方，但是在实验中我们通过比较发现猪腹背最长肌的Ⅱ型肌纤维明显高于腰大肌，其肉质也较差，同时也得到了IDH2基因的circRNA在腰大肌中的表达远高于腹背最长肌，由于本实验采集的样本是来自年龄性别体重饲养条件几乎无差异的六只二花脸猪，因此可以推导出猪不同类型的骨骼肌的差异源于环状RNA的表达差异，由此可以认为如果能提高circRNA在肌纤维细胞中的表达量或含量，就有可能显著性的提高猪肉的肉质。为猪肉生产研究提供新的方向。通过一些对于circRNA的深入研究我们发现其形成过程受到剪接因子的调控，且多数具有序列保守性表达水平差异大，具有时空特异性及组织细胞特异性。如果能通过特异性的剪切因子帮助线性RNA形成环状RNA，将成为内源性药物来提高基因的表达水平来提进一步提高猪肉的品质，这无疑是为猪肉生产研究提供新的方向。致谢写作毕业论文是一次再系统学习的过程，毕业论文的完成，同时意味着新的学习工作的开始。我将铭记我是一名南农学子，在今后的工作中把南农的优良传统发扬光大。感谢各位专家的批评指导。参考文献[1] 任列娇, 赵素梅, 高士争. 乌金猪肌肉组织肌纤维类型分析[C]// 全国动物生理生化第十一次学术交流会论文汇编. 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Cell Death & Disease, 2017, 8(10):e3153.附录1 预测CircRNA 的基因位点IDLocationStrandExonsCircRNA lengthGene symbolssc-ciR-00071chrX:106978781-106988101-2312AMOTssc-ciR-00080chrX:115991641-116006863-5320THOC2ssc-ciR-00081chrX:116341277-116352321-9735STAG2ssc-ciR-00097chrX:130750806-130763718-71229ATP11Cssc-ciR-00282chr1:110525007-110548336+2698MADH4ssc-ciR-00285chr1:114019115-114019268-4485MBD2ssc-ciR-00320chr1:127997792-128040020+3299TEX9ssc-ciR-00343chr1:134782800-134790152-6821USP8ssc-ciR-00373chr1:144984557-145007808-3805RTF1ssc-ciR-00678chr2:2992757-3002697+3229PPP6R3ssc-ciR-00784chr2:52168906-52169771-3348MRVI1ssc-ciR-00799chr2:61870481-61872040+6797BRD4ssc-ciR-00895chr2:91206106-91230855+2221MSH3ssc-ciR-00905chr2:98306663-98326796+3311TMEM161Bssc-ciR-00923chr2:120022509-120028042+6565SLC25A46ssc-ciR-00968chr2:142477139-142478346-5507SAR1Bssc-ciR-01485chr4:55329544-55333311-3292WWP1ssc-ciR-01553chr4:85304080-85367540+141910PCMTD1ssc-ciR-01727chr4:139855413-139864288-3693PKN2ssc-ciR-01866chr5:68122726-68128063-3260C12orf4ssc-ciR-02610chr6:42900790-42902755+2273RYR1ssc-ciR-02611chr6:42948946-42949075+2144RYR1ssc-ciR-02648chr6:54305292-54306169-3945TNNT1;ssc-ciR-02668chr6:64542086-64545302-5702KIF1Bssc-ciR-02676chr6:69151419-69154853+3368DDI2ssc-ciR-02722chr6:85062797-85065591+1132ZMYM4ssc-ciR-02767chr6:99220824-99317549-5547ESCO1ssc-ciR-02801chr6:108625882-108627548-3307RNF138ssc-ciR-02816chr6:125570379-125576069-3340NEXNssc-ciR-02832chr6:137844859-137861689-5577ATG4Cssc-ciR-02976chr7:35673692-35676214-2235ANKS1Assc-ciR-03005chr7:57608749-57609962+6860WHAMMssc-ciR-03014chr7:60544560-60546813-171338IDH2;ssc-ciR-03096chr7:91976024-91982115-2153CHD2ssc-ciR-03113chr7:100085511-100087357-3574SLC8A3ssc-ciR-03305chr8:74821696-74824447-??MTHFD2Lssc-ciR-03308chr8:75774298-75779107-??SDAD1ssc-ciR-03349chr8:93154226-93168617-??SETD7ssc-ciR-03551chr9:29740806-29743556-1153CEP295ssc-ciR-03595chr9:44292299-44293899+??PPP2R1Bssc-ciR-03688chr9:108522657-108524946-1101CACNA2D1ssc-ciR-03761chr9:138073301-138107955-??C1orf21ssc-ciR-03907chr10:46681559-46779066-??ZEB1ssc-ciR-04310chr12:47804288-47833910-5795SSH2ssc-ciR-04329chr12:53698947-53721538-5670RABEP1ssc-ciR-04427chr13:22823028-22825406-114853ARPP21ssc-ciR-04429chr13:23758062-23758266-52530LRRFIP2ssc-ciR-04435chr13:25467655-25487285-74430EXOGssc-ciR-04807chr13:210047703-210050422+222285MORC3ssc-ciR-04917chr14:37533454-37534498+5840FBXO21ssc-ciR-04937chr14:44169276-44175988-375934ACACBssc-ciR-04966chr14:53342470-53344161+??SMARCB1ssc-ciR-04998chr14:60127643-60145000-3383ARID4Bssc-ciR-05012chr14:65238370-65238710-??ACTA1;ssc-ciR-05036chr14:77540654-77542707-2185HNRNPH3ssc-ciR-05170chr14:146703125-146704738-05963EDRF1ssc-ciR-05470chr15:117585543-117585738-3382BMPR2ssc-ciR-05552chr15:156994989-156997659-??NEBssc-ciR-05737chr17:42215076-42215249+2322CHMP4Bssc-ciR-05763chr17:49153502-49171103+5588TOP1ssc-ciR-05799chr18:1457167-1463300+1478DNAJB6ssc-ciR-05854chr18:14764050-14766324+2321CNOT4ssc-ciR-05887chr18:27477940-27488803-3315CPED1附录2 CircRNA 缺口位置及引物基因引物缺口位置ACACBF: CTGCTTGCAGGAAGACCTCAACCCAA GTGGGCA R: TGTTGGCGGCAAGGTAGATTAGLF: GCCCACAGATAGACCGGAACATGAAG GCAAAAR: GGAGAATTCCAACGGCGACTATG4C F: GGTGATTCCCCCTTGACTCTCTGTAAG AACAAAR: TCCAAGCAATAACACAGGGGAATRX F: TTGCTGAAAGGGAGCGTGAGAGAGAG GAGATGR: GCCTATGTCTGTATCTCGGCTTCTSLF: TTTGGTGGTTGGCTATGGCTGAACAG GAAACAR: AGATGAATGGCCCGCATCAADDI2F: TAATGAGGCTGGTGGATCGTCATCTAG GCAACAGR: AAAGGCTTTCACAGGATGTCCADEKF: GCCAGGAAAGCTAAGCGAACGAGGAG AAAAGAR: GACACTGTGCCTGGTCTGTTDNAJB6F: AGAAGGATTGAACGGTGGCATCTTCG GGACTGR: TGTCTCTGCACGCCTAGAACEDRF1F: AAAACACTCTCTGGGGCTCTTGACCAG GTTGGTR: TCTAAGCAGTTCACACGGAGCEMC21F: TGAAATATGCTAGTTGGGCAGCTATCAG GCTGCAR: GCAAGTTCATGCCAGGCTTCFCHO2F: TTTGCACCAGTGTGGGATGTGAAAAG GGGGAAR: TGTCATTGACCTGGAGTATGCCHADHF: GATTTGCCGGGCTCCATTTCTGCAAG GTTGCTR: TACCAACACTACCGTGTGGCHNRNPH3F: AATGCGACGAGGAGGTGATGGAAGAG CATTTAR: TGGCACGATTTCCAACCCTTHOMERF: AGTAGCCAAGCAAATGCAGTGCTACAG TTCAGCR: AGCCTCCCAATGTTTGCTGAHSPA4F: CTGAAGGAGACGGCAGAAAGTGTTTCG GGCTTGR: 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目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.1.1仪器 2
1.1.2试剂 2
1.2试验方法 2
1.2.1猪肉样本的采集与RNA提取3
1.2.2 RNA的纯度检测实验 3
1.2.3 RTPCR进行逆转录及产物测序4
1.2.4 RealTime PCR比较不同代谢类型肌纤维骨骼肌的cirRNA表达水平 5
1.2.5 circRNA功能验证实验6
2结果与分析6
2.1猪肉样本RNA纯度6
2.2猪不同肌肉中肌球蛋白重链基因表达结果 7
2.3特异性高表达circRNA序列选择及验证结果 7
2.4目的circRNA的验证 8
2.5cirRNAIDH2功能预测10
3讨论 11
致谢 12
参考文献 12
附录1 猪所有预测可能的circRNA 14
附录2 67个circRNA切口与引物设计16
猪不同代谢类型骨骼肌差异表达的环形RNA的筛选及其
功能分析
引言
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