钙离子受体介导苯丙氨酸影响猪十二指肠胃肠激素分泌的机制研究
钙离子受体在结构上属于G蛋白偶联受体家族，负责细胞内外的信号转导。有研究表明十二指肠粘膜有钙离子受体表达，为了探究钙离子受体介导苯丙氨酸影响猪十二指肠胃肠激素分泌的机制，本实验采用体外灌流系统，模拟猪十二指肠环境，分别采用不同浓度苯丙氨酸；添加CaSR特异性抑制剂NPS 2143；添加钙离子三种不同实验方案进行体外灌流，通过对灌流液中激素水平，以及十二指肠细胞内基因表达水平的检测，进行探究。结果发现，苯丙氨酸能够明显增加胃肠激素如CCK等的分泌量，显著上调CaSR及胃肠激素基因的表达（P < 0.05）；苯丙氨酸引起的CCK、GLP-1和GIP的分泌受NPS 2143调控，其分泌受到NPS 2143的显著抑制（P < 0.05），NPS 2143还显著下调苯丙氨酸诱导的CaSR及胃肠激素基因的表达（P < 0.05），并显著抑制了CaSR及其下游信号蛋白的表达（P < 0.05）说明NPS 2143是CaSR的特异性拮抗剂。Ca2+是CaSR的天然配体，可以显著促进苯丙氨酸诱导的胃肠激素的分泌（P < 0.05），上调CaSR和胃肠激素基因的表达（P < 0.05）。综上所述，苯丙氨酸可以促进猪十二指肠胃肠激素的分泌，这种促进作用可能是通过激活CaSR来介导的。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Keywords4
引言4
1材料与方法4
1.1体外灌流系统的建立4
1.2仪器和试剂4
1.3实验设计5
1.3.1不同浓度LPhe对猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及胃肠激素分泌的影响5
1.3.2 CaSR抑制剂（NPS 2143）对LPhe引起的猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及分泌的影响5
1.3.3 Ca2+对Phe调控的CaSR和胃肠激素基因表达及分泌的影响5
1.4测定指标5
1.4.1胃肠激素5
1.4.2 CaSR表达量以及胃肠激素基因表达量分析6
1.5 数据分析7
2结果与分析7
2.1不同浓度LPhe对猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及胃肠激素分泌的影响7
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.2 CaSR抑制剂（NPS 2143）对LPhe引起的猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及分泌的影响8
2.3Ca2+对Phe调控的CaSR和胃肠激素基因表达及分泌的影响10
3讨论 11
致谢 12
参考文献12
钙离子受体介导苯丙氨酸影响猪十二指肠胃肠激素分泌 的机制研究
引言
钙敏感受体 (Calcium sensing receptor，CaSR) 1993年由Brown等在牛甲状旁腺主细胞中首先发现,并证实了它是一个G蛋白耦联的受体[1~2]。胃肠道具有消化食物、吸收营养等重要功能，且参与水、盐代谢。有研究表明，胃的黏膜和肌层都有CaSR表达，CaSR还可以调节胃酸的分泌，并参与损伤上皮的修复[3]；CaSR还广泛存在于绒毛、小肠和结肠的腺细胞以及肠肌层等部位[4]，具有调整肠蠕动及结肠细胞的增生、分化等功能；有机营养受体激动剂和变构调节剂如多胺、L氨基酸，可以激活CaSR，可能与胃肠上皮细胞获取营养有关[5]。近来有研究表明，Phe作为CaSR的激动剂,能够促进胃肠激素的分泌[6]。Nakajima等[7]通过体外培养小鼠内分泌细胞STC1发现Phe可以激活CaSR，进而启动细胞内钙动员引起CCK的分泌。Mace等[6]通过对大鼠小肠体外灌流，发现了CaSR参与调控Phe对GLP1、PYY、GIP的促分泌作用。但猪十二指肠CaSR是否参与Phe调控胃肠激素的分泌尚不清楚。所以，本试验旨在探讨猪十二指肠CaSR对胃肠激素分泌的影响效应及其特征关系，并在此基础上初步探索CaSR调控胃肠激素分泌的相关信号通路。为进一步阐明CaSR调控胃肠激素分泌的机制奠定基础。
1 材料与方法
1．1 体外灌流系统的建立
体外灌流系统由氧气瓶，贮液瓶，恒流泵，导管（硅胶管），，恒温水浴锅，灌流小室，收集灌流液的收集管等组成，其中，灌流小室是由2.5ml注射器改装而成，具体组装方式见图1，整个系统组装方式见图2。
1．2 仪器和试剂
L苯丙氨酸（Lphenylalanine）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自SigmaAldrich（中国，上海）；NaCl，葡萄糖，Kreb’s 培养液（其组分见表1）；NPS 2143购自MedChem Express（中国，上海）；猪CCK（FUZ044；CCK8 antibody，orb10260，biorbyt）、GLP1（FUZ189；GLP1 antibody, orb10719 biorbyt）、PYY（FUZ240；PYY antibody，LSC191185400，LifeSpan BioSciences）及GIP（FUA192；GIP antibody，GTX37687，GeneTex）ELISA试剂盒购自北京方程佰金科技有限公司（中国，北京）；总RNA提取试剂RNAiso Plus（9108/9109）、PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）（DRR047A）和SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）均购自TaKaRa（中国，大连）。
pH计；酶标仪（Thermo，USA）；SteponePlus? RealTime PCR System（Life Technologies，USA）；超微量分光光度计（Thermo，USA）；低温高速离心机（Eppendorf，Germany）。
Kreb’s培养液主要成分如下：
表1 Kreb’s培养液主要成分
NaCl
HEPES
KCl
CaCl2
MgCl26H2O
Glucose
dH2O
8.00g
6.00g
0.30g
0.20g
0.20g
7.00g
1000.0mL
1．3 试验设计
取新鲜屠宰的猪十二指肠，保留部分胃，并尽快运送回实验室进行取样，取十二指肠近端23㎝，在漂洗液中除去脂肪和食糜等杂物，将肠用剪刀剪碎，混匀，分别称取400mg随机放入灌流小室中，培养液以6 mL/h的速度灌流。每20 min收集一管，连续收集160min。灌流结束后，将收集的灌流液和十二指肠组织分别保存在20℃和液氮中，待测。
1.3.1 不同浓度LPhe对猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及胃肠激素分泌的影响
Kreb’s 培养液是实验的基础溶液，设置Phe组三组（分别加入0、20mM、50mM Phe）和空白对照组。通过体外灌流系统对猪的十二指肠近端组织进行灌流。在灌流开始的0min收集各组灌流液，每20min收集一次，连续收集160min。收集到的灌流液测定胃肠激素含量，十二指肠组织则提取其中的RNA并进行Realtime PCR扩增，以检测CaSR的表达和胃肠激素基因的表达。
1.3.2 CaSR抑制剂（NPS 2143）对LPhe引起的猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及分泌的影响
在基础液中分别加入DMSO(对照)、20mM Phe、20mM Phe+NPS 2143（CaSR抑制剂），通过该灌流系统对猪十二指肠近端组织进行灌流。同样在开始灌流的0min收集各组灌流液，每20min收集一管，连续收集160min。结束后，收集到的灌流液检测胃肠激素水平，收集十二指肠组织，进行RNA的提取和Realtime PCR分析。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Keywords4
引言4
1材料与方法4
1.1体外灌流系统的建立4
1.2仪器和试剂4
1.3实验设计5
1.3.1不同浓度LPhe对猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及胃肠激素分泌的影响5
1.3.2 CaSR抑制剂（NPS 2143）对LPhe引起的猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及分泌的影响5
1.3.3 Ca2+对Phe调控的CaSR和胃肠激素基因表达及分泌的影响5
1.4测定指标5
1.4.1胃肠激素5
1.4.2 CaSR表达量以及胃肠激素基因表达量分析6
1.5 数据分析7
2结果与分析7
2.1不同浓度LPhe对猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及胃肠激素分泌的影响7
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.2 CaSR抑制剂（NPS 2143）对LPhe引起的猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及分泌的影响8
2.3Ca2+对Phe调控的CaSR和胃肠激素基因表达及分泌的影响10
3讨论 11
致谢 12
参考文献12
钙离子受体介导苯丙氨酸影响猪十二指肠胃肠激素分泌 的机制研究
引言
钙敏感受体 (Calcium sensing receptor，CaSR) 1993年由Brown等在牛甲状旁腺主细胞中首先发现,并证实了它是一个G蛋白耦联的受体[1~2]。胃肠道具有消化食物、吸收营养等重要功能，且参与水、盐代谢。有研究表明，胃的黏膜和肌层都有CaSR表达，CaSR还可以调节胃酸的分泌，并参与损伤上皮的修复[3]；CaSR还广泛存在于绒毛、小肠和结肠的腺细胞以及肠肌层等部位[4]，具有调整肠蠕动及结肠细胞的增生、分化等功能；有机营养受体激动剂和变构调节剂如多胺、L氨基酸，可以激活CaSR，可能与胃肠上皮细胞获取营养有关[5]。近来有研究表明，Phe作为CaSR的激动剂,能够促进胃肠激素的分泌[6]。Nakajima等[7]通过体外培养小鼠内分泌细胞STC1发现Phe可以激活CaSR，进而启动细胞内钙动员引起CCK的分泌。Mace等[6]通过对大鼠小肠体外灌流，发现了CaSR参与调控Phe对GLP1、PYY、GIP的促分泌作用。但猪十二指肠CaSR是否参与Phe调控胃肠激素的分泌尚不清楚。所以，本试验旨在探讨猪十二指肠CaSR对胃肠激素分泌的影响效应及其特征关系，并在此基础上初步探索CaSR调控胃肠激素分泌的相关信号通路。为进一步阐明CaSR调控胃肠激素分泌的机制奠定基础。
1 材料与方法
1．1 体外灌流系统的建立
体外灌流系统由氧气瓶，贮液瓶，恒流泵，导管（硅胶管），，恒温水浴锅，灌流小室，收集灌流液的收集管等组成，其中，灌流小室是由2.5ml注射器改装而成，具体组装方式见图1，整个系统组装方式见图2。
1．2 仪器和试剂
L苯丙氨酸（Lphenylalanine）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自SigmaAldrich（中国，上海）；NaCl，葡萄糖，Kreb’s 培养液（其组分见表1）；NPS 2143购自MedChem Express（中国，上海）；猪CCK（FUZ044；CCK8 antibody，orb10260，biorbyt）、GLP1（FUZ189；GLP1 antibody, orb10719 biorbyt）、PYY（FUZ240；PYY antibody，LSC191185400，LifeSpan BioSciences）及GIP（FUA192；GIP antibody，GTX37687，GeneTex）ELISA试剂盒购自北京方程佰金科技有限公司（中国，北京）；总RNA提取试剂RNAiso Plus（9108/9109）、PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）（DRR047A）和SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）均购自TaKaRa（中国，大连）。
pH计；酶标仪（Thermo，USA）；SteponePlus? RealTime PCR System（Life Technologies，USA）；超微量分光光度计（Thermo，USA）；低温高速离心机（Eppendorf，Germany）。
Kreb’s培养液主要成分如下：
表1 Kreb’s培养液主要成分
NaCl
HEPES
KCl
CaCl2
MgCl26H2O
Glucose
dH2O
8.00g
6.00g
0.30g
0.20g
0.20g
7.00g
1000.0mL
1．3 试验设计
取新鲜屠宰的猪十二指肠，保留部分胃，并尽快运送回实验室进行取样，取十二指肠近端23㎝，在漂洗液中除去脂肪和食糜等杂物，将肠用剪刀剪碎，混匀，分别称取400mg随机放入灌流小室中，培养液以6 mL/h的速度灌流。每20 min收集一管，连续收集160min。灌流结束后，将收集的灌流液和十二指肠组织分别保存在20℃和液氮中，待测。
1.3.1 不同浓度LPhe对猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及胃肠激素分泌的影响
Kreb’s 培养液是实验的基础溶液，设置Phe组三组（分别加入0、20mM、50mM Phe）和空白对照组。通过体外灌流系统对猪的十二指肠近端组织进行灌流。在灌流开始的0min收集各组灌流液，每20min收集一次，连续收集160min。收集到的灌流液测定胃肠激素含量，十二指肠组织则提取其中的RNA并进行Realtime PCR扩增，以检测CaSR的表达和胃肠激素基因的表达。
1.3.2 CaSR抑制剂（NPS 2143）对LPhe引起的猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及分泌的影响
在基础液中分别加入DMSO(对照)、20mM Phe、20mM Phe+NPS 2143（CaSR抑制剂），通过该灌流系统对猪十二指肠近端组织进行灌流。同样在开始灌流的0min收集各组灌流液，每20min收集一管，连续收集160min。结束后，收集到的灌流液检测胃肠激素水平，收集十二指肠组织，进行RNA的提取和Realtime PCR分析。
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