乳酸链球菌素对瘤胃体外发酵参数及功能菌数量的影响
本试验旨在通过体外静态模拟瘤胃发酵法研究乳酸链球菌素（Nisin）对瘤胃发酵参数及功能菌数量的影响。试验以莫能菌素（5μM）做阳性对照，Nisin添加剂量分别为0mg、3mg、9mg、27mg/100ml，每个处理4个重复，分别于培养后的0、3、6、9、12、24h测定产气量和甲烷产量。培养24 h 后，采集发酵液样品，用于发酵参数和菌群数量的测定。结果显示与阴性对照组相比，各Nisin剂量组均显著降低产气量、甲烷产量、乙酸比例及乙丙比(P<0.05)，显著提高丙酸比例(P<0.05)，9mg组显著降低氨态氮浓度(P<0.05)，27mg组显著降低微生物蛋白浓度(P<0.05)，但对pH值、干物质消失率、有机物消失率无显著影响(P>0.05)；功能菌方面，总菌含量有降低的趋势，但不显著(P>0.05)，3mg和27mg组厚壁菌门含量显著降低(P<0.05)，9mg和27mg组硫还原菌含量显著升高(P<0.05)，真菌和拟杆菌门含量无显著变化(P>0.05)，原虫含量有升高趋势，甲烷菌含量有降低趋势，但均不显著(P>0.05)。阳性对照组中，pH值、总菌、原虫和拟杆菌门含量无显著变化(P>0.05)，硫还原菌和丙酸含量显著升高(P<0.05)，其余结果均显著降低(P<0.05)。结果表明适宜浓度的Nisin可以改变瘤胃发酵类型，增加丙酸摩尔百分比，显著抑制甲烷生成而不影响消化，这种改变与瘤胃功能菌群数量的变化密切相关。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言.............................................................................................................................................4
1 材料与方法 4
1．1 试验设计 4
1．2 试验材料 4
1．2．1 添加剂及发酵底物 4
1．2．2 瘤胃液采集及培养液配制 4
1．3 指标测定 5
1．3．1 产气量 5
1．3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
．2 甲烷 5
1．3．3 pH值 5
1．3．4 干物质消失率、有机物消失率 5
1．3．5 瘤胃氨态氮（NH3N） 5
1．3．6 微生物蛋白（MCP） 5
1．3．7 挥发酸（VFA） 5
1．4 功能菌群定量 5
1．4．1 DNA提取 5
1．4．2 DNA质量及浓度检测 5
1．4．3 Realtime PCR引物设计 5
1．4．4 反应体系与条件 6
1．5 数据分析 6
2 结果与分析 6
2．1 不同Nisin水平下产气量和甲烷产量的变化 6
2．1．1 产气量变化 6
2．1．2 甲烷产量变化 7
2．2 不同Nisin水平下瘤胃发酵参数的变化 7
2．2．1 pH值变化 7
2．2．2 干物质消失率、有机物消失率变化 7
2．2．3 瘤胃氨态氮浓度变化 7
2．2．4 微生物蛋白浓度变化 8
2．2．5 挥发酸浓度变化 8
2．3 不同Nisin水平下功能菌群数量的变化 8
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 10
乳酸链球菌素对瘤胃体外发酵参数及功能菌数量的影响
引言
我国是畜牧业大国，在反刍动物瘤胃代谢过程中，大约有2%15%的饲料能量以甲烷的形式被损失掉[1]，而甲烷是仅次于CO2的第二大温室气体。反刍动物甲烷的排放不仅影响环境，而且造成饲料能量的损失[2]；同时反刍动物生产上为了高产而滥用抗生素，造成残留、耐药性的产生，给人类健康以及生存环境带来不利影响[3]。因此，寻找抗生素替代物、改善反刍动物瘤胃消化代谢、提高动物的生产性能和饲料利用率已经成为目前主要的研究课题。
乳酸链球菌素（Nisin），商品名为尼辛，它是由一些乳酸链球菌产生的一种小分子多肽抗菌物质或细菌素[4]。Nisin对动物无毒，并且已经被美国FDA批准在人类食品中使用[5]。Nisin的作用机理主要是抑制革兰氏阳性菌的生长，其作用机理类似于离子载体抗生素，并能抑制芽胞杆菌属或梭状芽胞杆菌属胞子的形成，特别是Nisin作用完后可被酶直接降解，无残留，使其成为抗生素的理想替代物[6]。Nisin是目前研究最透彻的，也是目前唯一用于商业生产的细菌素[7]。目前，研究者在Nisin的合成、作用机理以及应用方面做了一定的成绩，但仍无法获知微生物机体内的生理分子反应机制[8]。生产上，Nisin已在食品生产的诸多方面有应用报道 [9]，但是目前把Nisin用在动物生产上的报道，特别是在反刍动物上的应用报道还很少，且Nisin的前期试验还开展的不多[10]。本试验利用体外静态模拟瘤胃发酵法，通过添加不同浓度Nisin来探讨其对瘤胃发酵参数及功能菌数量的影响，旨在为Nisin在反刍动物生产上的应用提供理论科学依据。
1 材料与方法
1．1 试验设计
本试验采用单因素多因子试验设计，设4个水平(0mg/100ml、3mg/100ml、9mg/100ml、27mg/100ml)，以及莫能菌素（5μM）作为阳性对照，每个处理四个重复。采用长江三角洲白山羊为瘤胃液供体，进行体外发酵。
1．2 试验材料
1．2．1 添加剂及发酵底物 试验所用Nisin为浙江新银象生物工程有限公司生产，标准品纯度为2.5%，活性为1×106 IU/g。发酵底物为0.5g混合精料（玉米34%、豆粕16%）和粉碎羊草0.5g。
1．2．2 瘤胃液采集及培养液配制 瘤胃液采自大学动物房三只健康成年长三角洲白山羊，干物质采食量按体重的3.5%计算，精粗比为6：4，自由饮水。早饲前按1：1：1的比例利用负压原理通过采集器经口腔采集瘤胃液保存于经39℃预热并充满二氧化碳的自封袋内，置于39℃保温杯中，并迅速带回实验室，经搅拌后用四层纱布过滤，过滤后的瘤胃液用来接种（在获取瘤胃液以及处理瘤胃液的整个过程均需要严格厌氧）。
培养液参照Theodorou等[11]方法配制（表1），培养液由A、B、C、D和E5部分组成，其中D是刃天青溶液，为厌氧指示剂，有氧时呈红色，厌氧时呈无色。在2341mL蒸馏水中加入4.5mL溶液A、936.45mL溶液B、936.45mL溶液C及4.5mL溶液D，通CO2饱和后放置于39℃恒温水浴箱中1516h，加入3.15g半胱氨酸盐酸盐及4.5gNa2S，混匀后通CO2至饱和并加热至39℃，继续通CO20.51.0h。过滤后的瘤胃液在厌氧条件下与缓冲液充分混合（瘤胃液：缓冲液体积比10:90），厌氧分装于发酵瓶中；发酵瓶中通入无氧CO2至加盖密封，将100mL培养液分装入发酵瓶中（90mL缓冲液+10mL瘤胃液）；使用异丁基塑胶塞塞住瓶口，再用铝盖密封，用针头放气平衡内外压力；置于39℃恒温水浴箱中恒温培养24h。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言.............................................................................................................................................4
1 材料与方法 4
1．1 试验设计 4
1．2 试验材料 4
1．2．1 添加剂及发酵底物 4
1．2．2 瘤胃液采集及培养液配制 4
1．3 指标测定 5
1．3．1 产气量 5
1．3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
．2 甲烷 5
1．3．3 pH值 5
1．3．4 干物质消失率、有机物消失率 5
1．3．5 瘤胃氨态氮（NH3N） 5
1．3．6 微生物蛋白（MCP） 5
1．3．7 挥发酸（VFA） 5
1．4 功能菌群定量 5
1．4．1 DNA提取 5
1．4．2 DNA质量及浓度检测 5
1．4．3 Realtime PCR引物设计 5
1．4．4 反应体系与条件 6
1．5 数据分析 6
2 结果与分析 6
2．1 不同Nisin水平下产气量和甲烷产量的变化 6
2．1．1 产气量变化 6
2．1．2 甲烷产量变化 7
2．2 不同Nisin水平下瘤胃发酵参数的变化 7
2．2．1 pH值变化 7
2．2．2 干物质消失率、有机物消失率变化 7
2．2．3 瘤胃氨态氮浓度变化 7
2．2．4 微生物蛋白浓度变化 8
2．2．5 挥发酸浓度变化 8
2．3 不同Nisin水平下功能菌群数量的变化 8
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 10
乳酸链球菌素对瘤胃体外发酵参数及功能菌数量的影响
引言
我国是畜牧业大国，在反刍动物瘤胃代谢过程中，大约有2%15%的饲料能量以甲烷的形式被损失掉[1]，而甲烷是仅次于CO2的第二大温室气体。反刍动物甲烷的排放不仅影响环境，而且造成饲料能量的损失[2]；同时反刍动物生产上为了高产而滥用抗生素，造成残留、耐药性的产生，给人类健康以及生存环境带来不利影响[3]。因此，寻找抗生素替代物、改善反刍动物瘤胃消化代谢、提高动物的生产性能和饲料利用率已经成为目前主要的研究课题。
乳酸链球菌素（Nisin），商品名为尼辛，它是由一些乳酸链球菌产生的一种小分子多肽抗菌物质或细菌素[4]。Nisin对动物无毒，并且已经被美国FDA批准在人类食品中使用[5]。Nisin的作用机理主要是抑制革兰氏阳性菌的生长，其作用机理类似于离子载体抗生素，并能抑制芽胞杆菌属或梭状芽胞杆菌属胞子的形成，特别是Nisin作用完后可被酶直接降解，无残留，使其成为抗生素的理想替代物[6]。Nisin是目前研究最透彻的，也是目前唯一用于商业生产的细菌素[7]。目前，研究者在Nisin的合成、作用机理以及应用方面做了一定的成绩，但仍无法获知微生物机体内的生理分子反应机制[8]。生产上，Nisin已在食品生产的诸多方面有应用报道 [9]，但是目前把Nisin用在动物生产上的报道，特别是在反刍动物上的应用报道还很少，且Nisin的前期试验还开展的不多[10]。本试验利用体外静态模拟瘤胃发酵法，通过添加不同浓度Nisin来探讨其对瘤胃发酵参数及功能菌数量的影响，旨在为Nisin在反刍动物生产上的应用提供理论科学依据。
1 材料与方法
1．1 试验设计
本试验采用单因素多因子试验设计，设4个水平(0mg/100ml、3mg/100ml、9mg/100ml、27mg/100ml)，以及莫能菌素（5μM）作为阳性对照，每个处理四个重复。采用长江三角洲白山羊为瘤胃液供体，进行体外发酵。
1．2 试验材料
1．2．1 添加剂及发酵底物 试验所用Nisin为浙江新银象生物工程有限公司生产，标准品纯度为2.5%，活性为1×106 IU/g。发酵底物为0.5g混合精料（玉米34%、豆粕16%）和粉碎羊草0.5g。
1．2．2 瘤胃液采集及培养液配制 瘤胃液采自大学动物房三只健康成年长三角洲白山羊，干物质采食量按体重的3.5%计算，精粗比为6：4，自由饮水。早饲前按1：1：1的比例利用负压原理通过采集器经口腔采集瘤胃液保存于经39℃预热并充满二氧化碳的自封袋内，置于39℃保温杯中，并迅速带回实验室，经搅拌后用四层纱布过滤，过滤后的瘤胃液用来接种（在获取瘤胃液以及处理瘤胃液的整个过程均需要严格厌氧）。
培养液参照Theodorou等[11]方法配制（表1），培养液由A、B、C、D和E5部分组成，其中D是刃天青溶液，为厌氧指示剂，有氧时呈红色，厌氧时呈无色。在2341mL蒸馏水中加入4.5mL溶液A、936.45mL溶液B、936.45mL溶液C及4.5mL溶液D，通CO2饱和后放置于39℃恒温水浴箱中1516h，加入3.15g半胱氨酸盐酸盐及4.5gNa2S，混匀后通CO2至饱和并加热至39℃，继续通CO20.51.0h。过滤后的瘤胃液在厌氧条件下与缓冲液充分混合（瘤胃液：缓冲液体积比10:90），厌氧分装于发酵瓶中；发酵瓶中通入无氧CO2至加盖密封，将100mL培养液分装入发酵瓶中（90mL缓冲液+10mL瘤胃液）；使用异丁基塑胶塞塞住瓶口，再用铝盖密封，用针头放气平衡内外压力；置于39℃恒温水浴箱中恒温培养24h。
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