猪细小病毒病的分子流行病学调查
猪细小病毒病的分子流行病学调查[20200507191002]
摘要：猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，自该病毒发现以来，给世界各国养猪业造成了巨大损失，我国东南部地区的猪群也出现了不同程度的感染。近十年来，多种新型猪细小病毒陆续被发现。本研究利用PCR方法，对2014年1月至4月送至实验室检测的病料，进行猪细小病毒1型（PPV1）、PPV2、PPV3、PPV4、猪博卡病毒（PBoV）、6V7V和猪类博卡病毒（PBo-likeV）检测，并做流行病学调查。结果显示，阳性率依次为3.2%、63.4%、15.1%、8.7%、11.9%、7.9%、11.1%。结合实验室PRRSV、PCV2和PRV的检测结果，对细小病毒与这3种病毒共感染情况进行初步分析，结果显示PPV2与PRRSV、PRV，PPV3与PCV2，PPV4与PRRSV、PCV2混合感染几率较高，提示它们在感染过程中可能存在协同作用。本研究为猪细小病毒流行病学、致病性和致病机理的研究提供了一定的参考。
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关键字:猪细小病毒；分子流行病学；调查
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.2 DNA提取 2
1.3 PCR检测 3
1.3.1 引物 3
1.3.2 PCR扩增 3
2 结果 3
2.1 PPV1检测结果 5
2.2 PPV2检测结果 5
2.3 PPV3检测结果 6
2.4 PPV4检测结果 6
2.5 PBoV检测结果 6
2.6 6V7V检测结果 7
2.7 PBo-likeV检测结果 7
3 讨论 7
3.1 PPV1流行病学分析 7
3.2 PPV2流行病学分析 7
3.3 PPV3流行病学分析 8
3.4 PPV4流行病学分析 8
3.5 PBoV流行病学分析 8
3.6 6V7V流行病学分析 8
3.7 PBo-likeV流行病学分析 9
致谢 9
参考文献 .9猪细小病毒感染的分子流行病学调查
引言
PPV属细小病毒科细小病毒属，二十面体等轴立体对称，无囊膜，直径约20~26nm。衣壳由32 个壳粒组成，核心含单股负链DNA，大小约5.2kb[1]。1967年猪细小病毒1型（Porcine parvovirus 1，PPV1）首次被报道发现，自2001年开始，陆续发现猪细小病毒2型（PPV2）、猪细小病毒3型（PPV3）、猪细小病毒4型（PPV4）、猪类博卡病毒（porc *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
ine boca-like virus，pbo-likev），猪博卡病毒（porcine bocavirus，PBoV）和猪博卡病毒6v7v等。其中，PPV1属于细小病毒属（Parvovirus），PPV2和PPV3属于香港病毒属（Hokovirus），PPV4、PBo-likeV、PBoV和6V7V属于博卡病毒属（Bocavirus）。
目前，世界各国对细小病毒的研究已取得了初步进展，但对其致病症状、致病机理、与其他病原混合感染情况研究的相对较少。本实验利用PCR方法，对2014年1月至4月送至实验室检测的病料，进行猪细小病毒1型（PPV1）、PPV2、PPV3、PPV4、猪博卡病毒（PBoV）、6V7V和猪类博卡病毒（PBo-likeV）检测，做流行病学调查。并结合实验室PRRSV、PCV2、PRV检测结果，分析各种细小病毒在我国东南部地区的感染情况以及与其他病原混合感染情况，以期为猪细小病毒流行病学的研究提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1实验材料
2014年1月至4月，江苏、山东、浙江、安徽、广西、四川、湖北、福建、江西、广东等十个省份的34个规模化猪场送至本实验室进行检测的病料，采自不同生长阶段的126头猪（流产死胎27份，仔猪34头，保育及育肥猪37头，另有不明年龄猪28头），共计149份组织样品（死胎27份，肺26份，小肠19份，脾10份，淋巴结6份，肾5份，心2份，混合病料54份）。
1.2 DNA提取
（1）剪碎的组织与PBS缓冲液1:4混合，匀浆，反复冻融3次
（2）取800μL匀浆，12000rpm，10min，4℃，取700μL上清至全新EP管（勿吸入下层杂质），加等体积氯仿(第一次吸氯仿时，第一滴会滑落)，剧烈振摇1min，静置5min，接着12000rpm，10min，4℃
（3）取600μL上清至全新EP管，加入终止液（1/10，60μL）10%SDS和终浓度为50μg/ml蛋白酶K，6μL，55℃水浴，组织毒4~5小时，细胞毒30min~1h
（4）加666μL（等体积）酚-氯仿，（上层的Tris阻隔空气与酚接触，吸时不能吸到Tris，吸出后，将枪头在瓶口转一圈，以减少枪头外壁吸附的Tris），剧烈振摇1min，静置5min，1200rpm，10min，4℃
（5）取500μL上清至全新EP管，加等体积氯仿剧烈振摇1min，静置5min，12000rpm，10min，4℃
（6）吸约400μL的上清至全新EP管，加3m NaAc 40μL，无水乙醇800μL，上下快速颠倒数次，-20℃，过夜
（7）12000rpm，4℃，15min，弃上清，风干，加20μL ddH2O溶解，-20℃保存（风干时不宜过长，溶解时吹打）
1.3 PCR检测
1.3.1 引物
参照文献[2]设计的引物，由上海Invitrogen公司合成。引物序列详见表1.
表1 PCR引物
引物名称 引物序列（5’-3’） 片段大小/bp 位置 退火温度/℃
PPV1F ATACAATTCTATTTCATGGGCCAGC 330 PPV1，ORF1 53
PPV1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
R TATGTTCTGGTCTTTCCTCGCATC
PPV2F ACACGATGAGCGGTACGA 279 PPV2，ORF2 55
PPV2R TCCTCACGAGGTCTCTTCTG
PPV3F GCAGTCTGCGCTTAACTT 392 PPV3，ORF2 55
PPV3R CTGCTTCATCCACTGGTC
PPV4F TCATAGCACTATGGCGAGC 284 PPV4，ORF2 50
PPV4R AGCATTCTGCGTTGGACA
PBoVF TGGTGGAACGTCTCTCTGACA 466 PBoV1、2，ORF2 58
PBoVR GAGTCATTCGGTCTCCTCCAT
PBo-likeVF GGGCGAGAACATTGAAGAGGT 495 PBo-likeV，ORF2 58
PBo-likeVR TTGTGAGTATGGGTATTGGTG
6V7VF ATCCGCTCATCGACTCCAGACT 587 6V7V，ORF2 58
6V7VR CGGAGGATGTGTCATCGGTAAG
1.3.2 PCR扩增
表5 细小病毒与PRRSV、PCV2、PRV混合感染情况（1）
病毒 PPV2 PPV3 PPV4
PPV2（+） PPV2（-） PPV3（+） PPV3（-） PPV4（+） PPV4（-）
摘要：猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，自该病毒发现以来，给世界各国养猪业造成了巨大损失，我国东南部地区的猪群也出现了不同程度的感染。近十年来，多种新型猪细小病毒陆续被发现。本研究利用PCR方法，对2014年1月至4月送至实验室检测的病料，进行猪细小病毒1型（PPV1）、PPV2、PPV3、PPV4、猪博卡病毒（PBoV）、6V7V和猪类博卡病毒（PBo-likeV）检测，并做流行病学调查。结果显示，阳性率依次为3.2%、63.4%、15.1%、8.7%、11.9%、7.9%、11.1%。结合实验室PRRSV、PCV2和PRV的检测结果，对细小病毒与这3种病毒共感染情况进行初步分析，结果显示PPV2与PRRSV、PRV，PPV3与PCV2，PPV4与PRRSV、PCV2混合感染几率较高，提示它们在感染过程中可能存在协同作用。本研究为猪细小病毒流行病学、致病性和致病机理的研究提供了一定的参考。
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关键字:猪细小病毒；分子流行病学；调查
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.2 DNA提取 2
1.3 PCR检测 3
1.3.1 引物 3
1.3.2 PCR扩增 3
2 结果 3
2.1 PPV1检测结果 5
2.2 PPV2检测结果 5
2.3 PPV3检测结果 6
2.4 PPV4检测结果 6
2.5 PBoV检测结果 6
2.6 6V7V检测结果 7
2.7 PBo-likeV检测结果 7
3 讨论 7
3.1 PPV1流行病学分析 7
3.2 PPV2流行病学分析 7
3.3 PPV3流行病学分析 8
3.4 PPV4流行病学分析 8
3.5 PBoV流行病学分析 8
3.6 6V7V流行病学分析 8
3.7 PBo-likeV流行病学分析 9
致谢 9
参考文献 .9猪细小病毒感染的分子流行病学调查
引言
PPV属细小病毒科细小病毒属，二十面体等轴立体对称，无囊膜，直径约20~26nm。衣壳由32 个壳粒组成，核心含单股负链DNA，大小约5.2kb[1]。1967年猪细小病毒1型（Porcine parvovirus 1，PPV1）首次被报道发现，自2001年开始，陆续发现猪细小病毒2型（PPV2）、猪细小病毒3型（PPV3）、猪细小病毒4型（PPV4）、猪类博卡病毒（porc *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
ine boca-like virus，pbo-likev），猪博卡病毒（porcine bocavirus，PBoV）和猪博卡病毒6v7v等。其中，PPV1属于细小病毒属（Parvovirus），PPV2和PPV3属于香港病毒属（Hokovirus），PPV4、PBo-likeV、PBoV和6V7V属于博卡病毒属（Bocavirus）。
目前，世界各国对细小病毒的研究已取得了初步进展，但对其致病症状、致病机理、与其他病原混合感染情况研究的相对较少。本实验利用PCR方法，对2014年1月至4月送至实验室检测的病料，进行猪细小病毒1型（PPV1）、PPV2、PPV3、PPV4、猪博卡病毒（PBoV）、6V7V和猪类博卡病毒（PBo-likeV）检测，做流行病学调查。并结合实验室PRRSV、PCV2、PRV检测结果，分析各种细小病毒在我国东南部地区的感染情况以及与其他病原混合感染情况，以期为猪细小病毒流行病学的研究提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1实验材料
2014年1月至4月，江苏、山东、浙江、安徽、广西、四川、湖北、福建、江西、广东等十个省份的34个规模化猪场送至本实验室进行检测的病料，采自不同生长阶段的126头猪（流产死胎27份，仔猪34头，保育及育肥猪37头，另有不明年龄猪28头），共计149份组织样品（死胎27份，肺26份，小肠19份，脾10份，淋巴结6份，肾5份，心2份，混合病料54份）。
1.2 DNA提取
（1）剪碎的组织与PBS缓冲液1:4混合，匀浆，反复冻融3次
（2）取800μL匀浆，12000rpm，10min，4℃，取700μL上清至全新EP管（勿吸入下层杂质），加等体积氯仿(第一次吸氯仿时，第一滴会滑落)，剧烈振摇1min，静置5min，接着12000rpm，10min，4℃
（3）取600μL上清至全新EP管，加入终止液（1/10，60μL）10%SDS和终浓度为50μg/ml蛋白酶K，6μL，55℃水浴，组织毒4~5小时，细胞毒30min~1h
（4）加666μL（等体积）酚-氯仿，（上层的Tris阻隔空气与酚接触，吸时不能吸到Tris，吸出后，将枪头在瓶口转一圈，以减少枪头外壁吸附的Tris），剧烈振摇1min，静置5min，1200rpm，10min，4℃
（5）取500μL上清至全新EP管，加等体积氯仿剧烈振摇1min，静置5min，12000rpm，10min，4℃
（6）吸约400μL的上清至全新EP管，加3m NaAc 40μL，无水乙醇800μL，上下快速颠倒数次，-20℃，过夜
（7）12000rpm，4℃，15min，弃上清，风干，加20μL ddH2O溶解，-20℃保存（风干时不宜过长，溶解时吹打）
1.3 PCR检测
1.3.1 引物
参照文献[2]设计的引物，由上海Invitrogen公司合成。引物序列详见表1.
表1 PCR引物
引物名称 引物序列（5’-3’） 片段大小/bp 位置 退火温度/℃
PPV1F ATACAATTCTATTTCATGGGCCAGC 330 PPV1，ORF1 53
PPV1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
R TATGTTCTGGTCTTTCCTCGCATC
PPV2F ACACGATGAGCGGTACGA 279 PPV2，ORF2 55
PPV2R TCCTCACGAGGTCTCTTCTG
PPV3F GCAGTCTGCGCTTAACTT 392 PPV3，ORF2 55
PPV3R CTGCTTCATCCACTGGTC
PPV4F TCATAGCACTATGGCGAGC 284 PPV4，ORF2 50
PPV4R AGCATTCTGCGTTGGACA
PBoVF TGGTGGAACGTCTCTCTGACA 466 PBoV1、2，ORF2 58
PBoVR GAGTCATTCGGTCTCCTCCAT
PBo-likeVF GGGCGAGAACATTGAAGAGGT 495 PBo-likeV，ORF2 58
PBo-likeVR TTGTGAGTATGGGTATTGGTG
6V7VF ATCCGCTCATCGACTCCAGACT 587 6V7V，ORF2 58
6V7VR CGGAGGATGTGTCATCGGTAAG
1.3.2 PCR扩增
表5 细小病毒与PRRSV、PCV2、PRV混合感染情况（1）
病毒 PPV2 PPV3 PPV4
PPV2（+） PPV2（-） PPV3（+） PPV3（-） PPV4（+） PPV4（-）
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