山羊副流感病毒3型js2013株n蛋白的原核表达及间接elisa抗体检测方法的建立
：山羊副流感病毒3型可引起山羊严重的呼吸道疾病，造成免疫抑制与组织损伤，引起广泛的发病与死亡。本研究将目的基因扩增后连接到质粒pET32a(+)上，构建重组质粒pET32a-N，并转化至原核表达系统大肠杆菌BL21感受态细胞中，经IPTG诱导表达出大量重组N蛋白。采用Ni 柱亲和层析法纯化重组蛋白，通过SDS-PAGE与Western blot鉴定，证明其具有良好的抗原性与特异性。利用纯化的蛋白作为包被抗原优化间接ELISA反应条件确定其最佳抗原包被浓度为1ug/ml、血清稀释度为1:200、血清作用时间为60min、酶标二抗工作浓度为1:6000、二抗反应时间为30min、底物显色时间为9min。通过对138份临床血清样品进行间接ELISA检测和HA-HI试验，可发现二者间符合率可达89.13%，证明本研究建立的间接ELISA检测方法可适用于临床样品的检测。
目录
摘要 1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言2
1 材料与方法2
1.1 毒株、载体、试剂2
1.2 引物设计合成2
1.3 病毒总RNA提取与RTPCR2
1.4 表达载体的构建与鉴定 3
1.5 重组N蛋白的表达、鉴定及纯化3
1.6 间接ELISA方法的建立3
1.6.1 最佳抗原包被浓度与血清稀释度的筛选3
1.6.2 待检血清作用时间的确定3
1.6.3 酶标二抗工作浓度的筛选3
1.6.4 酶标二抗反应时间的优化3
1.6.5显色时间的优化4
1.6.6临界值确定4
1.7 重复性试验 4
1.8 临床样品检测与符合性试验 4
2 结果与分析4
2.1 目的基因的扩增与重组质粒的构建 4
2.2 重组N蛋白的表达、鉴定 4
2.3间接ELISA反应条件的选择与临界值确定 5
2.3.1最佳抗原包被浓度与血清稀释度的筛选5
2.3.2血清孵育时间的选择5
2.3.3酶标二抗工作浓度的优
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化5
2.3.4二抗反应时间的优化5
2.3.5底物显色时间的选择6
2.3.6临界值的确定6
2.4 重复性实验 6
2.4.1批内重复性试验6
2.4.2批间重复性试验6
2.5 临床样品检测与符合性比较 6
3讨论7
致谢8
参考文献8
图1 目的基因PCR结果4
图2 重组质粒pET32aN的双酶切4
图3 SDSPAGE鉴定 5
图4 Western blot鉴定 5
图5 纯化蛋白的SDSPAGE电泳结果 5
表1 方阵实验筛选最佳抗原包被浓度与血清稀释度6
表2 血清孵育时间的选择 6
表3 酶标二抗工作浓度的筛选 7
表4 酶标二抗反应时间的优化 7
表5 显色时间的优化 7
表6 20份阴性血清检测结果 7
表7 138份临床血清检测结果 7
山羊副流感病毒3型JS2013株N蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
目录
摘要 1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言2
1 材料与方法2
1.1 毒株、载体、试剂2
1.2 引物设计合成2
1.3 病毒总RNA提取与RTPCR2
1.4 表达载体的构建与鉴定 3
1.5 重组N蛋白的表达、鉴定及纯化3
1.6 间接ELISA方法的建立3
1.6.1 最佳抗原包被浓度与血清稀释度的筛选3
1.6.2 待检血清作用时间的确定3
1.6.3 酶标二抗工作浓度的筛选3
1.6.4 酶标二抗反应时间的优化3
1.6.5显色时间的优化4
1.6.6临界值确定4
1.7 重复性试验 4
1.8 临床样品检测与符合性试验 4
2 结果与分析4
2.1 目的基因的扩增与重组质粒的构建 4
2.2 重组N蛋白的表达、鉴定 4
2.3间接ELISA反应条件的选择与临界值确定 5
2.3.1最佳抗原包被浓度与血清稀释度的筛选5
2.3.2血清孵育时间的选择5
2.3.3酶标二抗工作浓度的优
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化5
2.3.4二抗反应时间的优化5
2.3.5底物显色时间的选择6
2.3.6临界值的确定6
2.4 重复性实验 6
2.4.1批内重复性试验6
2.4.2批间重复性试验6
2.5 临床样品检测与符合性比较 6
3讨论7
致谢8
参考文献8
图1 目的基因PCR结果4
图2 重组质粒pET32aN的双酶切4
图3 SDSPAGE鉴定 5
图4 Western blot鉴定 5
图5 纯化蛋白的SDSPAGE电泳结果 5
表1 方阵实验筛选最佳抗原包被浓度与血清稀释度6
表2 血清孵育时间的选择 6
表3 酶标二抗工作浓度的筛选 7
表4 酶标二抗反应时间的优化 7
表5 显色时间的优化 7
表6 20份阴性血清检测结果 7
表7 138份临床血清检测结果 7
山羊副流感病毒3型JS2013株N蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
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