猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂的初步筛选
猪瘟病毒能引起猪的高度接触性感染，有极高的病死率。本课题主要针对猪瘟病毒疫苗的耐热冻干保护剂配方进行筛选测试。试验使用右旋糖酐、蔗糖、乳糖、甘露醇、硫脲等成分配伍成无明胶无蛋白的9(D1～D9)个不同组方，对猪瘟兔化弱毒苗进行真空冷冻干燥，获得性状为疏松海绵状的粉色冻干疫苗。冻干后0 d疫苗的兔体温热反应试验结果显示配方D6和配方D8冻干疫苗保持有较高的效价，效价为10×104 RID/mL，优于其他配方。37 ℃ 10 d加速耐老化试验的兔体热反应试验表明配方D1和配方D6保护剂对疫苗的耐热保护效果较好，其他配方保护剂效果较差。综合试验结果说明配方D6保护剂对猪瘟病毒具有较好的耐热保护性能。动物试验结果表无明胶无蛋白的CSFV冻干疫苗副反应减少，能够作为猪瘟兔化弱毒疫苗冻干保护剂配方研发改进的参考依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1试验动物2
1.1.2毒株2
1.1.3主要试剂2
1.2主要设备2
2方法2
2.1耐热保护剂的设计与配制3
2.2猪瘟耐热活疫苗的冻干3
2.3冻干后0 d病毒效价检测3
2.4 37℃10 d加速耐老化试验4
2.5冻干疫苗的残水测定方法4
2.6耐热配方安全性试验4
3结果与分析5
3.1保护剂配制结果5
3.2冻干后疫苗性状5
3.3冻干后0 d疫苗试验结果5
3.4冻干疫苗37℃10 d加速耐老化试验结果6
3.5冻干疫苗外观及残余水分测定7
3.6耐热配方安全性试验结果8
4讨论8
致谢9
参考文献9
猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂的初步筛选
动物药学 申学会
引言
猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，死亡率高达80
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
%～90 %，也是世界粮农组织和各国政府密切关注的重要传染病之一，OIE国际委员会《国际卫生法典》(2002版)中，猪瘟被列为A类15种法定传染病之一。我国把猪瘟列为一类传染病。虽然芬兰、澳大利亚、加拿大、日本、英国等20多个国家已宣布消灭猪瘟，但近年来随着国际贸易的增加，一些宣布已消灭猪瘟的国家如法国、荷兰、德国、比利时等又见猪瘟复发的报道。近年来，我国因各种疾病死亡的生猪占饲养总数的8 ％～10 ％，其中1／3由猪瘟致死，每年造成巨大的经济损失，和巨大的人力和资源浪费［1］。针对我国畜牧业的生产现状，采取疫苗防制仍是预防猪瘟的主要措施，因而研制开发安全、高效、稳定的猪瘟疫苗仍是当前兽医科研工作的重点。
我国在1956年开始推广猪瘟兔化弱毒疫苗，最初提倡就地制苗，就地使用。继而研制真空冷冻干燥疫苗成功，集中生产，统一供应。冻干苗便于保存，成为我国防制HC的有力工具。开始时采用家兔淋脾组织制苗，每只家兔所制疫苗可供300头猪免疫。1964年将猪瘟兔化弱毒接种乳兔，研制成功乳兔苗，对猪仍保持较好的免疫原性和弱毒性。每只乳兔所制疫苗可供1500头猪使用，大大提高了产量，降低了成本，自1965年起在全国推广使用。接着又用猪瘟兔化弱毒接种牛，病毒可在牛体内繁殖，淋脾毒价可达到乳兔水平，便于就地制苗或生产厂制造冻干苗。在偏僻山区用牛生产牛体反应苗深受欢迎。1974年黑龙江兽医研究所用原代猪肾细胞培养猪瘟兔化弱毒制苗，获得成功，但不能适应于规模化生产的需要。1975年开始由中国兽医药品监察所组织全国兽医药品生产厂进行病毒型疫苗转为细胞培养制苗的技术革新，将猪瘟兔化弱毒接种原代肾细胞进行工厂化制苗。1978～1980年，有13家兽用生物药品厂生产猪肾细胞苗，并用细胞毒配制猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联冻干苗，在全国大量使用。1980年我国研制成功绵羊肾细胞苗，1982年研制成功奶山羊肾细胞苗，1985年生产出犊牛睾丸细胞苗，为HC疫苗生产开辟了一条新的道路。羊肾和犊牛睾丸细胞苗接种猪后3 d可产生免疫力，5 d可产生坚强的免疫力，免疫期均达到一年[23]。王栋[4]等发明了耐热冻干保护剂配方和制造耐热冻干活疫苗的技术，获得发明专利。
但是，目前常用的猪瘟活疫苗冻干保护剂组方简单，大多含有蔗糖、明胶、牛血清白蛋白、水解乳蛋白等成分，但临床上已发现注射冻干疫苗时由明胶和外源蛋白引起的过敏等副作用，例如注射部位轻微肿胀、暂时性减食反应和精神沉郁等，严重的会出现过敏反应，呼吸加快、粘膜充血、肌肉震颤等，如抢救不及时可导致死亡[5]；此外，传统的的保护剂耐热性能差，需要在冷冻条件下15 ℃才能长期保存。为了克服猪瘟活疫苗常规冻干保护剂不耐热，储藏温度低、保存期短、副反应等缺点，根据市场需求我们对无明胶无蛋白的猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂进行了初步筛选、试制，以期获得耐热性能好、安全性高的猪瘟冻干疫苗。
1 材料与设备
1.1材料
1.1.1试验动物 金陵种兔场新西兰家兔，选取兔子日龄90 d～115 d，重量1.5 Kg～2.0 Kg，健康状况良好兔子。20日龄的健康易感断奶猪40头。
1.1.2毒株 猪瘟兔化弱毒株C株（细胞源）接种易感细胞培养，收获。(由南京天邦生物科技有限公司提供，病毒含量20×104 RID/mL)。
1.1.3主要试剂 右旋糖酐、蔗糖、乳糖、甘露醇、硫脲等，110 ℃ 20 min高压灭菌的生理盐水、去离子水、双抗。
1.2 主要设备
试验用到的主要设备有超净工作台（airtech）、冷冻干燥机（VirTis Advantage Plus Es53）、真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司 DZF6020型）、电子分析天平（LING PING FA2004）、隔水式恒温培养箱（精宏）、37 ℃ 恒温干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、磁力搅拌器(金坛荣华仪器制造有限公司)、无线自动测温设备。
2 方法
2.1耐热保护剂的设计和配制
查阅相关文献[8]后并结合实验室前提研究结果设计出9(D1～D9)个无明胶无蛋白的保护剂配方，保护剂分两部分（A液和B液）配制，A液是由耐高温的保护剂组分组成，按配方总体积的质量百分比称重后用去离子水定容至200 mL，110 ℃高压20 min。B液是由不耐高温的保护剂组分组成，按配方总体积的质量百分比称重后用去离子水定容至200 mL，过滤除菌，4 ℃保存。A液B液等体积比混合即制成保护剂，4 ℃保存。
2.2猪瘟耐热活疫苗的冻干
将猪瘟抗原液和耐热保护剂按体积比1∶1无菌混合均匀后分装至5 mL西林瓶中，2 mL/瓶，待冻干。具体冻干程序如下：
将分装好的样品置入冻干机箱体内，在常压、4 ℃条件下预冷30 min，然后按照1 ℃/min的速度降温至40 ℃，在40 ℃维持4 h；将冻干机的冷阱降至50 ℃，冻干机箱体内抽真空至350 mTorr，然后将隔板以0.5 ℃/min的速度升温至25 ℃，在25 ℃维持16 h，之后以0.25 ℃/min的速度升温至15 ℃，在15℃维持10 h，最后以0.5 ℃/min 升温至20 ℃，在20 ℃维持5 h。整个冻干全程约40 h[9]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1试验动物2
1.1.2毒株2
1.1.3主要试剂2
1.2主要设备2
2方法2
2.1耐热保护剂的设计与配制3
2.2猪瘟耐热活疫苗的冻干3
2.3冻干后0 d病毒效价检测3
2.4 37℃10 d加速耐老化试验4
2.5冻干疫苗的残水测定方法4
2.6耐热配方安全性试验4
3结果与分析5
3.1保护剂配制结果5
3.2冻干后疫苗性状5
3.3冻干后0 d疫苗试验结果5
3.4冻干疫苗37℃10 d加速耐老化试验结果6
3.5冻干疫苗外观及残余水分测定7
3.6耐热配方安全性试验结果8
4讨论8
致谢9
参考文献9
猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂的初步筛选
动物药学 申学会
引言
猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，死亡率高达80
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
%～90 %，也是世界粮农组织和各国政府密切关注的重要传染病之一，OIE国际委员会《国际卫生法典》(2002版)中，猪瘟被列为A类15种法定传染病之一。我国把猪瘟列为一类传染病。虽然芬兰、澳大利亚、加拿大、日本、英国等20多个国家已宣布消灭猪瘟，但近年来随着国际贸易的增加，一些宣布已消灭猪瘟的国家如法国、荷兰、德国、比利时等又见猪瘟复发的报道。近年来，我国因各种疾病死亡的生猪占饲养总数的8 ％～10 ％，其中1／3由猪瘟致死，每年造成巨大的经济损失，和巨大的人力和资源浪费［1］。针对我国畜牧业的生产现状，采取疫苗防制仍是预防猪瘟的主要措施，因而研制开发安全、高效、稳定的猪瘟疫苗仍是当前兽医科研工作的重点。
我国在1956年开始推广猪瘟兔化弱毒疫苗，最初提倡就地制苗，就地使用。继而研制真空冷冻干燥疫苗成功，集中生产，统一供应。冻干苗便于保存，成为我国防制HC的有力工具。开始时采用家兔淋脾组织制苗，每只家兔所制疫苗可供300头猪免疫。1964年将猪瘟兔化弱毒接种乳兔，研制成功乳兔苗，对猪仍保持较好的免疫原性和弱毒性。每只乳兔所制疫苗可供1500头猪使用，大大提高了产量，降低了成本，自1965年起在全国推广使用。接着又用猪瘟兔化弱毒接种牛，病毒可在牛体内繁殖，淋脾毒价可达到乳兔水平，便于就地制苗或生产厂制造冻干苗。在偏僻山区用牛生产牛体反应苗深受欢迎。1974年黑龙江兽医研究所用原代猪肾细胞培养猪瘟兔化弱毒制苗，获得成功，但不能适应于规模化生产的需要。1975年开始由中国兽医药品监察所组织全国兽医药品生产厂进行病毒型疫苗转为细胞培养制苗的技术革新，将猪瘟兔化弱毒接种原代肾细胞进行工厂化制苗。1978～1980年，有13家兽用生物药品厂生产猪肾细胞苗，并用细胞毒配制猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联冻干苗，在全国大量使用。1980年我国研制成功绵羊肾细胞苗，1982年研制成功奶山羊肾细胞苗，1985年生产出犊牛睾丸细胞苗，为HC疫苗生产开辟了一条新的道路。羊肾和犊牛睾丸细胞苗接种猪后3 d可产生免疫力，5 d可产生坚强的免疫力，免疫期均达到一年[23]。王栋[4]等发明了耐热冻干保护剂配方和制造耐热冻干活疫苗的技术，获得发明专利。
但是，目前常用的猪瘟活疫苗冻干保护剂组方简单，大多含有蔗糖、明胶、牛血清白蛋白、水解乳蛋白等成分，但临床上已发现注射冻干疫苗时由明胶和外源蛋白引起的过敏等副作用，例如注射部位轻微肿胀、暂时性减食反应和精神沉郁等，严重的会出现过敏反应，呼吸加快、粘膜充血、肌肉震颤等，如抢救不及时可导致死亡[5]；此外，传统的的保护剂耐热性能差，需要在冷冻条件下15 ℃才能长期保存。为了克服猪瘟活疫苗常规冻干保护剂不耐热，储藏温度低、保存期短、副反应等缺点，根据市场需求我们对无明胶无蛋白的猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂进行了初步筛选、试制，以期获得耐热性能好、安全性高的猪瘟冻干疫苗。
1 材料与设备
1.1材料
1.1.1试验动物 金陵种兔场新西兰家兔，选取兔子日龄90 d～115 d，重量1.5 Kg～2.0 Kg，健康状况良好兔子。20日龄的健康易感断奶猪40头。
1.1.2毒株 猪瘟兔化弱毒株C株（细胞源）接种易感细胞培养，收获。(由南京天邦生物科技有限公司提供，病毒含量20×104 RID/mL)。
1.1.3主要试剂 右旋糖酐、蔗糖、乳糖、甘露醇、硫脲等，110 ℃ 20 min高压灭菌的生理盐水、去离子水、双抗。
1.2 主要设备
试验用到的主要设备有超净工作台（airtech）、冷冻干燥机（VirTis Advantage Plus Es53）、真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司 DZF6020型）、电子分析天平（LING PING FA2004）、隔水式恒温培养箱（精宏）、37 ℃ 恒温干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、磁力搅拌器(金坛荣华仪器制造有限公司)、无线自动测温设备。
2 方法
2.1耐热保护剂的设计和配制
查阅相关文献[8]后并结合实验室前提研究结果设计出9(D1～D9)个无明胶无蛋白的保护剂配方，保护剂分两部分（A液和B液）配制，A液是由耐高温的保护剂组分组成，按配方总体积的质量百分比称重后用去离子水定容至200 mL，110 ℃高压20 min。B液是由不耐高温的保护剂组分组成，按配方总体积的质量百分比称重后用去离子水定容至200 mL，过滤除菌，4 ℃保存。A液B液等体积比混合即制成保护剂，4 ℃保存。
2.2猪瘟耐热活疫苗的冻干
将猪瘟抗原液和耐热保护剂按体积比1∶1无菌混合均匀后分装至5 mL西林瓶中，2 mL/瓶，待冻干。具体冻干程序如下：
将分装好的样品置入冻干机箱体内，在常压、4 ℃条件下预冷30 min，然后按照1 ℃/min的速度降温至40 ℃，在40 ℃维持4 h；将冻干机的冷阱降至50 ℃，冻干机箱体内抽真空至350 mTorr，然后将隔板以0.5 ℃/min的速度升温至25 ℃，在25 ℃维持16 h，之后以0.25 ℃/min的速度升温至15 ℃，在15℃维持10 h，最后以0.5 ℃/min 升温至20 ℃，在20 ℃维持5 h。整个冻干全程约40 h[9]。
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