转录抑制因子plzf在小鼠睾丸中的表达特征分析
研究发现早幼粒细胞白血病锌指蛋白（promyelocytic leukaemia zinc finger, PLZF）在哺乳动物精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）的发育分化过程中扮演着重要角色。为了探究PLZF在小鼠睾丸发育中的表达特征，文章通过免疫荧光染色、RT-PCR、Western Blot 等方法从细胞、mRNA 及蛋白质水平进行分析。结果显示，随着小鼠睾丸的发育，PLZF阳性细胞的数量基本保持不变，但PLZF阳性细胞占睾丸总细胞数量的比例明显降低。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法3
1.1 材料4
1.1.1 主要试剂4
1.1.2 主要仪器4
1.1.3 实验动物4
1.2 方法4
1.2.1免疫组织化学检测PLZF的表达4
1.2.2 RTPCR检测Plzf mRNA的表达5
1.2.3 Western Blot分析PLZF蛋白的表达6
2 结果与分析6
2.1 免疫组织化学染色检测PLZF在不同发育阶段睾丸内的表达6
2.2 RTPCR检测Plzf mRNA在在小鼠睾丸各发育阶段的表达特征7
2.3 Western Blot检测PLZF蛋白在小鼠睾丸各发育阶段的表达特征8
3 讨论8
致谢9
参考文献9
图1 7
图2 7
图 3 8
图 4 8
转录抑制因子PLZF在小鼠睾丸中的表达特征分析
引言
引言 早幼粒细胞白血病锌指蛋白（promyelocytic leukaemia zinc finger, PLZF）发现于一个急性早幼粒细胞白血病病例。该患者具有t(11; 17)(q23; q21) 染色体易位而15号染色体正常，染色体易位后形成的PLZFRARα和RARαPLZF融合基因引起早幼粒细胞白血病[1]。PLZF蛋白的C端包含9个Krup *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
pel样C2H2 锌指结构，N端为BTB/ POZ结构域[2]。PLZF蛋白位于细胞核内名为核斑的区域[3]。研究认为，当PLZF蛋白位于上述核区时，PLZF能够抑制转录作用，反之，当PLZF蛋白移置核斑外面，它对转录的抑制活性就会丢失[4]。除已知PLZF与造血机制相关外，早前的研究显示PLZF在神经发育[5]、骨骼形成[6]等过程中也发挥重要功能。
精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）是一种具有自我更新能力和分化潜能的成体干细胞。SSCs受到多种自身及内外环境因素的影响与调节，通过平衡自我更新与分化，不仅能维持干细胞数目稳定，还同时维持正常的精子发生[7]。有研究发现PLZF在未分化的精原细胞中有很高的表达，而进入分化阶段后PLZF的表达量大幅降低[8]，因此PLZF在生殖系统中对精原干细胞的维持可能起到了非常重要的作用。
本研究对5日龄、10日龄、20日龄和42日龄的雄性小鼠睾丸进行PLZF IHC染色、RTPCR和Western Blot分析，并找出每组睾丸中PLZF与细胞的变化规律、Plzf mRNA的表达变化特征以及PLZF蛋白的表达变化特征。结果显示，随着小鼠睾丸的发育，PLZF阳性细胞的数量基本维持不变，PLZF阳性细胞占睾丸总细胞的比例明显降低，PLZF的表达也逐渐降低。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1.1 主要试剂 FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(天根生物科技有限公司), TRNzol总RNA提取试剂（天根生物科技有限公司），其他常规生化试剂均为国产AR级。
1.1.2 主要仪器 电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司)、电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、移液枪（德国Eppendorf公司）、荧光显微镜（Olympus公司）、全自动PCR仪(德国Eppendorf公司)、电泳仪（北京六一仪器厂）、凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）等。
1.1.3 实验动物 出生后5日龄、10日龄、20日龄、42日龄雄性ICR小鼠，购于南京市青龙山动物繁殖场。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学检测PLZF的表达
1) 动物处理 取出生后5日龄、10日龄、20日龄和42日龄雄性小鼠各3只，颈椎脱臼法处死；无菌条件下剪开小鼠皮肤层及腹膜，暴露内脏，分离睾丸周围组织，完整剪下小鼠睾丸。
2) 组织包埋及切片
a. 固定：将取下的小鼠睾丸放入包埋盒，浸入甲醛溶液，过夜固定；
b. 脱水：固定好的组织用PBS溶液洗20 min，之后依次放入50%、70%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ、100%Ⅲ的乙醇溶液中，每次45 min；
c. 透明：将脱水后的组织依次放入透明剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中，每次45 min；
d. 浸蜡：将透明后的组织依次放入石蜡Ⅰ、Ⅱ中，每次1 h；
e. 包埋：提前打开60℃烘蜡箱，使石蜡融化，将包埋铁盒、包埋框、装有蜡的小黄盖及大小两个镊子放入烘蜡机中预热，将浸过蜡的组织用尖头镊拨松动，放入装满融蜡的小黄盖中，将铁盒中倒入蜡，记15 min，将组织夹入包埋铁盒，盖上包埋框，记35 min，补加满石蜡，记1 min，取出，室温凝固后4℃过夜；
f. 切片：打开37.5℃水浴锅，500 mL烧杯中加入去离子水进行预热，将包埋好的组织固定在切片机上，顺时针切片。镊子夹起一端缓慢放入烧杯中展3 min，玻片垂直水面捞起，竖放过夜。
3) 免疫荧光染色（IHC染色）
a. 选择组织形态完整的小鼠睾丸组织玻片，60℃烤片45 min；
b. 二甲苯脱蜡2次，20 min/次；
c. 放入梯度浓度的乙醇溶液中复水，100%乙醇放置2次，5 min/次，90%乙醇放置5 min，80%乙醇放置5 min，50%乙醇放置5 min，PBS溶液洗10 min；
d. 使用微波抗原修复法，玻片放入0.01M pH=6.0柠檬酸钠中，最高温档加热2.5 min左右至沸腾，沸腾后补加满柠檬酸钠，盖好容器盖子，最低温档加热15 min，冷却至室温，回收柠檬酸钠；
e. 玻片用PBS洗3次，5 min/次；
f. 甲醇/H2O2 溶液中室温放置15 min，回收甲醇/H2O2 溶液；
g. 玻片用PBS洗3次，5 min/次；
h. 玻片上加入含5%山羊血清的PBS，室温封闭30 min；
i. 实验组织加入含1%山羊血清的一抗（PLZF抗体，1: 150），对照组织加PBS，将玻片放入湿盒中，37℃放置1 h，或者4℃过夜；
j. PBS洗3次，10 min/次；
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法3
1.1 材料4
1.1.1 主要试剂4
1.1.2 主要仪器4
1.1.3 实验动物4
1.2 方法4
1.2.1免疫组织化学检测PLZF的表达4
1.2.2 RTPCR检测Plzf mRNA的表达5
1.2.3 Western Blot分析PLZF蛋白的表达6
2 结果与分析6
2.1 免疫组织化学染色检测PLZF在不同发育阶段睾丸内的表达6
2.2 RTPCR检测Plzf mRNA在在小鼠睾丸各发育阶段的表达特征7
2.3 Western Blot检测PLZF蛋白在小鼠睾丸各发育阶段的表达特征8
3 讨论8
致谢9
参考文献9
图1 7
图2 7
图 3 8
图 4 8
转录抑制因子PLZF在小鼠睾丸中的表达特征分析
引言
引言 早幼粒细胞白血病锌指蛋白（promyelocytic leukaemia zinc finger, PLZF）发现于一个急性早幼粒细胞白血病病例。该患者具有t(11; 17)(q23; q21) 染色体易位而15号染色体正常，染色体易位后形成的PLZFRARα和RARαPLZF融合基因引起早幼粒细胞白血病[1]。PLZF蛋白的C端包含9个Krup *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
pel样C2H2 锌指结构，N端为BTB/ POZ结构域[2]。PLZF蛋白位于细胞核内名为核斑的区域[3]。研究认为，当PLZF蛋白位于上述核区时，PLZF能够抑制转录作用，反之，当PLZF蛋白移置核斑外面，它对转录的抑制活性就会丢失[4]。除已知PLZF与造血机制相关外，早前的研究显示PLZF在神经发育[5]、骨骼形成[6]等过程中也发挥重要功能。
精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）是一种具有自我更新能力和分化潜能的成体干细胞。SSCs受到多种自身及内外环境因素的影响与调节，通过平衡自我更新与分化，不仅能维持干细胞数目稳定，还同时维持正常的精子发生[7]。有研究发现PLZF在未分化的精原细胞中有很高的表达，而进入分化阶段后PLZF的表达量大幅降低[8]，因此PLZF在生殖系统中对精原干细胞的维持可能起到了非常重要的作用。
本研究对5日龄、10日龄、20日龄和42日龄的雄性小鼠睾丸进行PLZF IHC染色、RTPCR和Western Blot分析，并找出每组睾丸中PLZF与细胞的变化规律、Plzf mRNA的表达变化特征以及PLZF蛋白的表达变化特征。结果显示，随着小鼠睾丸的发育，PLZF阳性细胞的数量基本维持不变，PLZF阳性细胞占睾丸总细胞的比例明显降低，PLZF的表达也逐渐降低。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1.1 主要试剂 FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(天根生物科技有限公司), TRNzol总RNA提取试剂（天根生物科技有限公司），其他常规生化试剂均为国产AR级。
1.1.2 主要仪器 电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司)、电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、移液枪（德国Eppendorf公司）、荧光显微镜（Olympus公司）、全自动PCR仪(德国Eppendorf公司)、电泳仪（北京六一仪器厂）、凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）等。
1.1.3 实验动物 出生后5日龄、10日龄、20日龄、42日龄雄性ICR小鼠，购于南京市青龙山动物繁殖场。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学检测PLZF的表达
1) 动物处理 取出生后5日龄、10日龄、20日龄和42日龄雄性小鼠各3只，颈椎脱臼法处死；无菌条件下剪开小鼠皮肤层及腹膜，暴露内脏，分离睾丸周围组织，完整剪下小鼠睾丸。
2) 组织包埋及切片
a. 固定：将取下的小鼠睾丸放入包埋盒，浸入甲醛溶液，过夜固定；
b. 脱水：固定好的组织用PBS溶液洗20 min，之后依次放入50%、70%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ、100%Ⅲ的乙醇溶液中，每次45 min；
c. 透明：将脱水后的组织依次放入透明剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中，每次45 min；
d. 浸蜡：将透明后的组织依次放入石蜡Ⅰ、Ⅱ中，每次1 h；
e. 包埋：提前打开60℃烘蜡箱，使石蜡融化，将包埋铁盒、包埋框、装有蜡的小黄盖及大小两个镊子放入烘蜡机中预热，将浸过蜡的组织用尖头镊拨松动，放入装满融蜡的小黄盖中，将铁盒中倒入蜡，记15 min，将组织夹入包埋铁盒，盖上包埋框，记35 min，补加满石蜡，记1 min，取出，室温凝固后4℃过夜；
f. 切片：打开37.5℃水浴锅，500 mL烧杯中加入去离子水进行预热，将包埋好的组织固定在切片机上，顺时针切片。镊子夹起一端缓慢放入烧杯中展3 min，玻片垂直水面捞起，竖放过夜。
3) 免疫荧光染色（IHC染色）
a. 选择组织形态完整的小鼠睾丸组织玻片，60℃烤片45 min；
b. 二甲苯脱蜡2次，20 min/次；
c. 放入梯度浓度的乙醇溶液中复水，100%乙醇放置2次，5 min/次，90%乙醇放置5 min，80%乙醇放置5 min，50%乙醇放置5 min，PBS溶液洗10 min；
d. 使用微波抗原修复法，玻片放入0.01M pH=6.0柠檬酸钠中，最高温档加热2.5 min左右至沸腾，沸腾后补加满柠檬酸钠，盖好容器盖子，最低温档加热15 min，冷却至室温，回收柠檬酸钠；
e. 玻片用PBS洗3次，5 min/次；
f. 甲醇/H2O2 溶液中室温放置15 min，回收甲醇/H2O2 溶液；
g. 玻片用PBS洗3次，5 min/次；
h. 玻片上加入含5%山羊血清的PBS，室温封闭30 min；
i. 实验组织加入含1%山羊血清的一抗（PLZF抗体，1: 150），对照组织加PBS，将玻片放入湿盒中，37℃放置1 h，或者4℃过夜；
j. PBS洗3次，10 min/次；
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