母猪胎盘发育对胎猪生长发育的影响
母猪胎盘发育对胎猪生长发育的影响[20200507185725]
摘要： 3
摘要：胎盘是妊娠期胎儿在母体内生长和发育的重要器官，胎儿主要通过胎盘血液循环系统与母体进行气体交换，获得营养物质以及排泄代谢产物。同时胎盘也是维系胎儿在子宫内正常发育的重要器官，也是各种致病因素影响胎儿的作用渠道。猪因其多胎性造成胎盘容量相对不足最容易发生宫内生长迟缓（IGUR），IGUR仔猪出生后通常伴随着较高的发病率和死亡率，且适应性较差，对畜牧业经济造成巨大的危害。本实验选用体重为40kg左右的70胎龄初次妊娠环香猪，分别选取最小体重，最大体重及平均体重胎儿并记录胎儿体重。取相应胎儿母猪的胎盘组织样品进行研究，结果表明：不同体重仔猪对应母猪胎盘的asct2、bo+ct以及其他13种基因表达量均没有显著差异，而在最高体重胎猪对应胎盘ATB（0，+）基因表达显著高于最小体重和平均体重胎儿（P<0.05）。
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关键字:胎盘血管；营养物质转运；胎猪发育
目录
引言
胎盘是维系母体与胎儿间物质转运、气体交换与血液循环的唯一器官，也是基因、环境、表观遗传及母体成熟度影响胎儿的作用渠道，更是各种病原菌侵入感染影响胎儿宫内发育的必经途径[1]。
挪威最新的研究显示，妊娠期仔猪的生长发育情况依赖于胎盘[2]，在妊娠期间，胎盘替代了胎儿的肺、消化系统及肝肾的功能，同时产生肾上腺、性腺、垂体和下丘脑激素，胎盘面积和胎盘重量也会影响分娩后仔猪的存活率[3]。
宫内生长迟缓（IGUR）是围产期的主要并发症之一，可导致动物出生后短时间内死亡，或在出生后生长发育迟缓并且具有较高发病率，如神经系统发育的滞后、心血管疾病、慢性肺病、肾脏疾病及糖代谢异常等[4]，进而影响其生产性能。研究发现，胎盘的血管发育和滋养层以及营养物质的运输与IUGR的发生是有一定关联的。Szukiewicz等[5]研究表明IUGR发生的一个重要原因是胎盘绒毛血管发育障碍，主要表现是绒毛数量少，扩张能力差。此外病理妊娠的发生有时伴随缺氧缺血，而胎盘滋养层细的胞适应缺氧环境是成功妊娠的关键[6]。缺氧条件下胎盘滋养层细胞的反应性异常如凋亡和自噬增殖和分化异常就有可能导致病理IUGR发生[7]。
胎盘面积小可造成妊娠期胎儿营养的吸收不足，但胎盘可通过增加其血管密度保证胎儿的正常发育[ 8]。而IUGR的发生主要是由母体、胎儿和胎盘等多方面病理因素导致胎儿应用营养物质障碍和营养物质供给障碍[9]。本实验目的是探讨母猪的胎盘发育和营养物质运输与IUGR仔猪之间的关系，从而减少IUGR带来的不良影响，提高母猪繁殖性能。
1 材料与方法
1.1.1 实验样品
本实验选用体重为40kg左右的70胎龄初次妊娠环香猪，随机选取8头进行宰杀。分别选取最小体重，最大体重及平均体重胎 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
儿并记录胎儿体重。取相应胎儿母猪的胎盘组织样品，并于液氮中储存。
1.1.2 实验试剂
DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。（DEPC水需先高压，高压时注意：装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出）。
75%乙醇：无水乙醇：DEPC水=3:1。异丙醇：储存于棕色瓶中。氯仿：储存于棕色瓶中。RNase-Free DNase（生兴货号：M6101，Promega，规格：1000U，1 U/μL），M-MLV Reverse Transcriptase（生兴货号：M1701，Promega，规格：10000U，200U/μL，50μL，50次），Random primer（生兴货号：C1181）；（TaKaRa货号：D3801，80 nmol/150 μg/5 OD，干粉需自行溶解），dNTP Mixture（10 mM each）：常规试剂，可在各处订货（生兴货号：D0056），RNAase 抑制剂 常使用生兴（生兴货号：R0004-1000U，40U/μL，50μL，40次，稀释随机引物：将引物干粉在12000 rpm/min离心5min后，加入DEPC水600 μL，充分混匀后，即得到0.25 μg/μL的随机引物溶液。
1.1.3 主要仪器
纯水仪（MΜL9000）；多用途高速冷冻离心机（Velocity 18R）；制冰机（先欧）；低温离心机（17R Thermo）；ND-1000 微量紫外分光光度计；BIO RAD versa分子成像系统；Veriti 96孔热循环仪；Agilent实时荧光定量PCR仪Mx3000P。
1. 2 方法
1.2.1样品RNA提取
研磨成粉后取100 mg粉末于EP管内，加入1 mL RNA提取试剂(TrizolReagent)，用细胞破碎仪匀浆取上清。加入0.2 mL氯仿剧烈震荡60s，室温静置3 min后4℃ 12000 r/min离心15 min。上清液于新1.5 mL EP管内，加入0.5 mL异丙醇，上下颠倒混匀，室内静置10 min后4℃ 12000 r/min离心15 min，弃上清。加入75%乙醇1 mL，上下颠倒洗漆管壁，12000 r/min离心15 min，4℃，弃上清，使乙醇流出而保留沉淀物。待管内液体挥发后加入30 μL DEPC处理水溶解沉淀，检测RNA提取浓度。
1.2.2 RNA变性胶的验证
将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。配制琼脂糖凝胶。称取0.4g琼脂糖，置干净的100 ml锥形瓶中，加入40 ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶凉至60℃~70℃，依次向其中加入9 ml甲醛、5ml 10× MOPS缓冲液，混合均匀。灌制琼脂糖凝胶。样品准备：取DEPC处理过的500 μL小离心管，依次加入如下试剂：10x?MOPS缓冲液2μL，甲醛3.6μL，甲酰胺（去离子）10μL，RNA?样品4.4?μL，混匀。将离心管置于65℃水浴中保15 min，再置冰上2 min。向管中加入0.5μL上样染料，混匀。上样。电泳： *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于100v的电压下电泳。电泳结束后，在紫外灯下检查结果。
1.2.3 反转成cDNA
将提取的样品RNA 取2 μL并加入10×DNase Reaction Buffer 1μL，DNase 2μL，以及DEPC水4μL。混匀离心，放入普通PCR，37℃ 30 min。加入DNase Stop Solution 1 μL，再混匀，离心，65℃ 10 min。再加Random primer 0.5μL，然后再混匀，离心，70℃ 5 min。立即将PCR管插入冰中，之后离心。然后再分别加入Annealed RNA 11.5μL，dNTPs1μLM-MLV Buffer 5μL，RNase抑制剂0.5μL，M-MLV 1μL，DEPC水6μL。混匀，离心，30℃ 10 min，40℃ 60 min，70℃ 10 min。
1.2.4 引物设计
表一 基因引物序列
Table 1 The Primer sequences of the target genes
目的基因 Target gene 引物序列（5到3） Primer sequences
Bax-F TGACGGCAACTTCAACTGGG
Bax-R GCAGCCGATCTCGAAGGAA
Bcl-2-F GCCTTTGTGGAGCTGTATGG
Bcl-2-R CCCGTGGACTTCACTTATGG
TNFα-F GCCGTCTCCTACCAGACCAA
TNFα-R GCCCAGATTCAGCAAAGTCC
TNFR2-F GGCTTCCGAATACAAACCTCA
TNFR2-R CTAAAGCACGCAGAAACCGA
CAT1-F GCAGGTCGTTTGGGAGGA
CAT1-R CTGTGGCTAAAGGGTGGC
CAT2-F ccgggatggcttactgttta
摘要： 3
摘要：胎盘是妊娠期胎儿在母体内生长和发育的重要器官，胎儿主要通过胎盘血液循环系统与母体进行气体交换，获得营养物质以及排泄代谢产物。同时胎盘也是维系胎儿在子宫内正常发育的重要器官，也是各种致病因素影响胎儿的作用渠道。猪因其多胎性造成胎盘容量相对不足最容易发生宫内生长迟缓（IGUR），IGUR仔猪出生后通常伴随着较高的发病率和死亡率，且适应性较差，对畜牧业经济造成巨大的危害。本实验选用体重为40kg左右的70胎龄初次妊娠环香猪，分别选取最小体重，最大体重及平均体重胎儿并记录胎儿体重。取相应胎儿母猪的胎盘组织样品进行研究，结果表明：不同体重仔猪对应母猪胎盘的asct2、bo+ct以及其他13种基因表达量均没有显著差异，而在最高体重胎猪对应胎盘ATB（0，+）基因表达显著高于最小体重和平均体重胎儿（P<0.05）。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:胎盘血管；营养物质转运；胎猪发育
目录
引言
胎盘是维系母体与胎儿间物质转运、气体交换与血液循环的唯一器官，也是基因、环境、表观遗传及母体成熟度影响胎儿的作用渠道，更是各种病原菌侵入感染影响胎儿宫内发育的必经途径[1]。
挪威最新的研究显示，妊娠期仔猪的生长发育情况依赖于胎盘[2]，在妊娠期间，胎盘替代了胎儿的肺、消化系统及肝肾的功能，同时产生肾上腺、性腺、垂体和下丘脑激素，胎盘面积和胎盘重量也会影响分娩后仔猪的存活率[3]。
宫内生长迟缓（IGUR）是围产期的主要并发症之一，可导致动物出生后短时间内死亡，或在出生后生长发育迟缓并且具有较高发病率，如神经系统发育的滞后、心血管疾病、慢性肺病、肾脏疾病及糖代谢异常等[4]，进而影响其生产性能。研究发现，胎盘的血管发育和滋养层以及营养物质的运输与IUGR的发生是有一定关联的。Szukiewicz等[5]研究表明IUGR发生的一个重要原因是胎盘绒毛血管发育障碍，主要表现是绒毛数量少，扩张能力差。此外病理妊娠的发生有时伴随缺氧缺血，而胎盘滋养层细的胞适应缺氧环境是成功妊娠的关键[6]。缺氧条件下胎盘滋养层细胞的反应性异常如凋亡和自噬增殖和分化异常就有可能导致病理IUGR发生[7]。
胎盘面积小可造成妊娠期胎儿营养的吸收不足，但胎盘可通过增加其血管密度保证胎儿的正常发育[ 8]。而IUGR的发生主要是由母体、胎儿和胎盘等多方面病理因素导致胎儿应用营养物质障碍和营养物质供给障碍[9]。本实验目的是探讨母猪的胎盘发育和营养物质运输与IUGR仔猪之间的关系，从而减少IUGR带来的不良影响，提高母猪繁殖性能。
1 材料与方法
1.1.1 实验样品
本实验选用体重为40kg左右的70胎龄初次妊娠环香猪，随机选取8头进行宰杀。分别选取最小体重，最大体重及平均体重胎 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
儿并记录胎儿体重。取相应胎儿母猪的胎盘组织样品，并于液氮中储存。
1.1.2 实验试剂
DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。（DEPC水需先高压，高压时注意：装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出）。
75%乙醇：无水乙醇：DEPC水=3:1。异丙醇：储存于棕色瓶中。氯仿：储存于棕色瓶中。RNase-Free DNase（生兴货号：M6101，Promega，规格：1000U，1 U/μL），M-MLV Reverse Transcriptase（生兴货号：M1701，Promega，规格：10000U，200U/μL，50μL，50次），Random primer（生兴货号：C1181）；（TaKaRa货号：D3801，80 nmol/150 μg/5 OD，干粉需自行溶解），dNTP Mixture（10 mM each）：常规试剂，可在各处订货（生兴货号：D0056），RNAase 抑制剂 常使用生兴（生兴货号：R0004-1000U，40U/μL，50μL，40次，稀释随机引物：将引物干粉在12000 rpm/min离心5min后，加入DEPC水600 μL，充分混匀后，即得到0.25 μg/μL的随机引物溶液。
1.1.3 主要仪器
纯水仪（MΜL9000）；多用途高速冷冻离心机（Velocity 18R）；制冰机（先欧）；低温离心机（17R Thermo）；ND-1000 微量紫外分光光度计；BIO RAD versa分子成像系统；Veriti 96孔热循环仪；Agilent实时荧光定量PCR仪Mx3000P。
1. 2 方法
1.2.1样品RNA提取
研磨成粉后取100 mg粉末于EP管内，加入1 mL RNA提取试剂(TrizolReagent)，用细胞破碎仪匀浆取上清。加入0.2 mL氯仿剧烈震荡60s，室温静置3 min后4℃ 12000 r/min离心15 min。上清液于新1.5 mL EP管内，加入0.5 mL异丙醇，上下颠倒混匀，室内静置10 min后4℃ 12000 r/min离心15 min，弃上清。加入75%乙醇1 mL，上下颠倒洗漆管壁，12000 r/min离心15 min，4℃，弃上清，使乙醇流出而保留沉淀物。待管内液体挥发后加入30 μL DEPC处理水溶解沉淀，检测RNA提取浓度。
1.2.2 RNA变性胶的验证
将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。配制琼脂糖凝胶。称取0.4g琼脂糖，置干净的100 ml锥形瓶中，加入40 ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶凉至60℃~70℃，依次向其中加入9 ml甲醛、5ml 10× MOPS缓冲液，混合均匀。灌制琼脂糖凝胶。样品准备：取DEPC处理过的500 μL小离心管，依次加入如下试剂：10x?MOPS缓冲液2μL，甲醛3.6μL，甲酰胺（去离子）10μL，RNA?样品4.4?μL，混匀。将离心管置于65℃水浴中保15 min，再置冰上2 min。向管中加入0.5μL上样染料，混匀。上样。电泳： *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于100v的电压下电泳。电泳结束后，在紫外灯下检查结果。
1.2.3 反转成cDNA
将提取的样品RNA 取2 μL并加入10×DNase Reaction Buffer 1μL，DNase 2μL，以及DEPC水4μL。混匀离心，放入普通PCR，37℃ 30 min。加入DNase Stop Solution 1 μL，再混匀，离心，65℃ 10 min。再加Random primer 0.5μL，然后再混匀，离心，70℃ 5 min。立即将PCR管插入冰中，之后离心。然后再分别加入Annealed RNA 11.5μL，dNTPs1μLM-MLV Buffer 5μL，RNase抑制剂0.5μL，M-MLV 1μL，DEPC水6μL。混匀，离心，30℃ 10 min，40℃ 60 min，70℃ 10 min。
1.2.4 引物设计
表一 基因引物序列
Table 1 The Primer sequences of the target genes
目的基因 Target gene 引物序列（5到3） Primer sequences
Bax-F TGACGGCAACTTCAACTGGG
Bax-R GCAGCCGATCTCGAAGGAA
Bcl-2-F GCCTTTGTGGAGCTGTATGG
Bcl-2-R CCCGTGGACTTCACTTATGG
TNFα-F GCCGTCTCCTACCAGACCAA
TNFα-R GCCCAGATTCAGCAAAGTCC
TNFR2-F GGCTTCCGAATACAAACCTCA
TNFR2-R CTAAAGCACGCAGAAACCGA
CAT1-F GCAGGTCGTTTGGGAGGA
CAT1-R CTGTGGCTAAAGGGTGGC
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