过表达cmyc基因对鸡卵泡发育的影响
禽类的产蛋性能由发育至等级发育阶段的卵泡数决定，而颗粒细胞的生长和分化是卵泡发育的标志之一。c-Myc被报道与细胞的增殖有关，且可能参与原始卵泡的启动。但国内外对c-Myc在鸡卵泡发育中研究还较少，主要是对人和其他动的研究得比较多。本文旨在探究c-Myc对鸡卵泡发育的影响。 本文主要是研究过表达c-Myc对鸡卵泡发育的影响。通过培养鸡颗粒细胞，建立过表达c-Myc基因质粒pEGFP-c-Myc，并转染至颗粒细胞中。最后检测颗粒细胞的增殖情况。结果显示，pEGFP-c-Myc转染至鸡颗粒细胞后，PCNA的表达量显著高于对照组的表达量。从而说明过表达的c-Myc基因对鸡卵泡发育具有促进作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1实验动物 3
1.2主要试剂3
1.3主要仪器3
1.4 主要溶液及配制4
1.5 实验方法4
1.5.1颗粒细胞的培养 4
1.5.2引物的设计 5
1.5.3 颗粒细胞总RNA提取5
1.5.4 cDNA的获得 6
1.5.5 质粒的构建6
1.5.6转染 6
1.5.7 Realtime PCR 6
2实验结果 6
2.1质粒构建 6
2.2质粒转染率 7
2.3 增殖基因表达8
3讨论8
3.1颗粒细胞的分离 8
3.1 cMyc的作用 8
致谢9
参考文献9
过表达cMyc基因对鸡卵泡发育的影响
动物科学 李永龙
引言
1． 颗粒细胞与卵泡的关系
禽类产蛋性能主要由发育至等级发育阶段的卵泡数决定。家禽卵泡发育的激素调节过程在很多方面与哺乳动物是相同的。但是在某些方面也存在一定的差异。家禽卵泡发育与哺乳动物的主要区别在于家禽卵巢上的卵泡可以连续地发育和成熟、排 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
卵，排卵后没有黄体的形成,因而也没有哺乳动物那样规则的发情周期。此外，家禽的卵大且无卵泡液。
卵巢卵泡是生长最快的正常组织之一，而与卵母细胞一起构成卵泡的体细胞颗粒细胞与内膜细胞的分化则是其生长的主要原因。在促性腺激素的调控下，卵泡中颗粒细胞增殖、分化，产生分化程度不一的颗粒细胞群。颗粒细胞合成多种激素及生长因子 ，并表达其受体 ，通过间隙连接调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟 ，进而调控卵泡的发育[1]。颗粒细胞能为卵母细胞提供营养物质。卵母细胞通过间隙连接从周围的颗粒细胞媒介中摄取小分子代谢物，如能量底物、氨基酸和核苷酸等[2]，来弥补卵母细胞摄取小分子 代谢能力 低的不足[3]。颗粒细胞通过间隙连接调节卵母细胞的转录活性，并诱导卵母细胞几种蛋白的转录后修饰[4]。有研究表明嘌呤、腺苷 、β吲哚酚等这些物质经间隙连接从颗粒细胞传递到卵母细胞，主要通过抑制磷酸二脂酶的活性积累cAM P，也可通过增强卵母细胞内 cA MP 的作用刺激依赖于 cAMP 蛋白质的激酶 ，或通过影响鸟苷的产量从而发挥抑制卵母细胞成熟分裂复始的作用[5] [6]。研究表明，颗粒细胞的生长启动比卵母细胞早，说明颗粒细胞的变化可作为卵泡生长启动的信号，也说明颗粒细胞的生长分化是原始卵泡启动 、生长的关键[7]。卵泡的成熟主要受垂体分泌的 LH 通过颗粒细胞介导调控 。当高浓度的雌性激素刺激垂体释放的L H 作用于颗粒细胞时， 既可诱导颗粒细胞合成和分泌激活减数分裂的甾醇, 抑制卵母细胞的腺苷酸环化酶活性，促使胞内 cAMP 含量下降 ，同时又诱导颗粒细胞分泌透明质酸， 使颗粒细胞和卵母细胞的间隙连接断裂 [8]。颗粒细胞不仅对卵泡发育有调控作用，它对卵泡闭锁也有一定的影响。卵泡闭锁是通过细胞凋亡方式实现的，细胞凋亡可以发生在卵泡发育的每个阶段。从形态上来看 ，卵泡闭锁有两种类型：一种起始于颗粒细胞，一种起始于卵母细胞。而颗粒细胞的凋亡是导致卵泡闭锁的重要且直接原因[9][10]。
2. cMyc基因
癌基因最初是在鸡Rous氏肉瘤的反转录病毒（Retrovirus.RSV）中分离得到的。cMyc 原癌基因（protooncogene）最初由鸡病毒vM yc原癌基因和同源物中分离出来。原癌基因家族包括3个相关基因 :cMyc ,nMyc , lMyc[11]。cMy c 属核转录因子类原癌基因 ,其编码的蛋白质在核内结合于 DNA 链上 ,对转录过程实施调控。cMyc 诱导化的形式为基因的大量扩增 ,它影响细胞增殖、转化需要通过其他基因和旁路系统,有直接调节其他基因的转录作用[12]。
目前国内外国外对cMyc基因在鸡卵泡发育中研究还较少，主要是对人和其他动的研究得比较多。陈五妍等采用免疫组织化学超敏感 SP 法、相邻切片比较法结合图像分析法对成年小鼠卵泡和黄体中 cMyc 癌基因蛋白分布和变化规律进行了研究, 结果显示:在卵泡发育、闭锁 、黄体形成及退化过程中, 除原始卵泡时期未见 cMyc 原癌基因蛋白的表达外, 其他时期都有它的微量表达 ,最大值出现在早期黄体中, 并且表达部位由卵泡中的核周围转移到黄体中的胞浆内, 在血管新生部位表达较强[13]。Chandramohan V[14] 研究显示 , Foxo3a因子激活以及 cMyc基因抑制通过 PI3K 信号传导通路来调节因子 p27kip1 的水平, p27kip1 在维持原始卵泡处于休眠状态 ,防止其过早激活中起着重要作用[15]。表明 cMyc基因可能参与原始卵泡的启动。
本研究立足于学科前沿，探究鸡卵泡发育的分子机制，为家禽育种提供相关的理论依据，促进家禽遗传育种与繁殖的研究。
1.实验方法与材料
1.1 实验动物
240日龄高产母鸡源于新曹农场玉谷草鸡
1.2主要试剂
DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胰酶、双抗、PBS缓冲液均购自Gibco公司，Trizol购自Invitrogen公司，DEPC、Tris、Na2EDTA2H2O、DNA Green、硼酸均购自南京鼎国公司，SYBR Premix Ex Taq为罗氏公司生产，DNA Marker、premix Taq Version、RNA反转录试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖购自景同晖有限公司。
1.3 主要仪器
超净工作台(苏州净化设备厂)
CO2细胞培养箱(NAPCO，USA)
离心机(北京医用离心机厂，LDS2A)
数码摄像机(pixerapro150Es，USA)
图象分析软件simplePCl(Compix，Inc，USA)
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1实验动物 3
1.2主要试剂3
1.3主要仪器3
1.4 主要溶液及配制4
1.5 实验方法4
1.5.1颗粒细胞的培养 4
1.5.2引物的设计 5
1.5.3 颗粒细胞总RNA提取5
1.5.4 cDNA的获得 6
1.5.5 质粒的构建6
1.5.6转染 6
1.5.7 Realtime PCR 6
2实验结果 6
2.1质粒构建 6
2.2质粒转染率 7
2.3 增殖基因表达8
3讨论8
3.1颗粒细胞的分离 8
3.1 cMyc的作用 8
致谢9
参考文献9
过表达cMyc基因对鸡卵泡发育的影响
动物科学 李永龙
引言
1． 颗粒细胞与卵泡的关系
禽类产蛋性能主要由发育至等级发育阶段的卵泡数决定。家禽卵泡发育的激素调节过程在很多方面与哺乳动物是相同的。但是在某些方面也存在一定的差异。家禽卵泡发育与哺乳动物的主要区别在于家禽卵巢上的卵泡可以连续地发育和成熟、排 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
卵，排卵后没有黄体的形成,因而也没有哺乳动物那样规则的发情周期。此外，家禽的卵大且无卵泡液。
卵巢卵泡是生长最快的正常组织之一，而与卵母细胞一起构成卵泡的体细胞颗粒细胞与内膜细胞的分化则是其生长的主要原因。在促性腺激素的调控下，卵泡中颗粒细胞增殖、分化，产生分化程度不一的颗粒细胞群。颗粒细胞合成多种激素及生长因子 ，并表达其受体 ，通过间隙连接调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟 ，进而调控卵泡的发育[1]。颗粒细胞能为卵母细胞提供营养物质。卵母细胞通过间隙连接从周围的颗粒细胞媒介中摄取小分子代谢物，如能量底物、氨基酸和核苷酸等[2]，来弥补卵母细胞摄取小分子 代谢能力 低的不足[3]。颗粒细胞通过间隙连接调节卵母细胞的转录活性，并诱导卵母细胞几种蛋白的转录后修饰[4]。有研究表明嘌呤、腺苷 、β吲哚酚等这些物质经间隙连接从颗粒细胞传递到卵母细胞，主要通过抑制磷酸二脂酶的活性积累cAM P，也可通过增强卵母细胞内 cA MP 的作用刺激依赖于 cAMP 蛋白质的激酶 ，或通过影响鸟苷的产量从而发挥抑制卵母细胞成熟分裂复始的作用[5] [6]。研究表明，颗粒细胞的生长启动比卵母细胞早，说明颗粒细胞的变化可作为卵泡生长启动的信号，也说明颗粒细胞的生长分化是原始卵泡启动 、生长的关键[7]。卵泡的成熟主要受垂体分泌的 LH 通过颗粒细胞介导调控 。当高浓度的雌性激素刺激垂体释放的L H 作用于颗粒细胞时， 既可诱导颗粒细胞合成和分泌激活减数分裂的甾醇, 抑制卵母细胞的腺苷酸环化酶活性，促使胞内 cAMP 含量下降 ，同时又诱导颗粒细胞分泌透明质酸， 使颗粒细胞和卵母细胞的间隙连接断裂 [8]。颗粒细胞不仅对卵泡发育有调控作用，它对卵泡闭锁也有一定的影响。卵泡闭锁是通过细胞凋亡方式实现的，细胞凋亡可以发生在卵泡发育的每个阶段。从形态上来看 ，卵泡闭锁有两种类型：一种起始于颗粒细胞，一种起始于卵母细胞。而颗粒细胞的凋亡是导致卵泡闭锁的重要且直接原因[9][10]。
2. cMyc基因
癌基因最初是在鸡Rous氏肉瘤的反转录病毒（Retrovirus.RSV）中分离得到的。cMyc 原癌基因（protooncogene）最初由鸡病毒vM yc原癌基因和同源物中分离出来。原癌基因家族包括3个相关基因 :cMyc ,nMyc , lMyc[11]。cMy c 属核转录因子类原癌基因 ,其编码的蛋白质在核内结合于 DNA 链上 ,对转录过程实施调控。cMyc 诱导化的形式为基因的大量扩增 ,它影响细胞增殖、转化需要通过其他基因和旁路系统,有直接调节其他基因的转录作用[12]。
目前国内外国外对cMyc基因在鸡卵泡发育中研究还较少，主要是对人和其他动的研究得比较多。陈五妍等采用免疫组织化学超敏感 SP 法、相邻切片比较法结合图像分析法对成年小鼠卵泡和黄体中 cMyc 癌基因蛋白分布和变化规律进行了研究, 结果显示:在卵泡发育、闭锁 、黄体形成及退化过程中, 除原始卵泡时期未见 cMyc 原癌基因蛋白的表达外, 其他时期都有它的微量表达 ,最大值出现在早期黄体中, 并且表达部位由卵泡中的核周围转移到黄体中的胞浆内, 在血管新生部位表达较强[13]。Chandramohan V[14] 研究显示 , Foxo3a因子激活以及 cMyc基因抑制通过 PI3K 信号传导通路来调节因子 p27kip1 的水平, p27kip1 在维持原始卵泡处于休眠状态 ,防止其过早激活中起着重要作用[15]。表明 cMyc基因可能参与原始卵泡的启动。
本研究立足于学科前沿，探究鸡卵泡发育的分子机制，为家禽育种提供相关的理论依据，促进家禽遗传育种与繁殖的研究。
1.实验方法与材料
1.1 实验动物
240日龄高产母鸡源于新曹农场玉谷草鸡
1.2主要试剂
DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胰酶、双抗、PBS缓冲液均购自Gibco公司，Trizol购自Invitrogen公司，DEPC、Tris、Na2EDTA2H2O、DNA Green、硼酸均购自南京鼎国公司，SYBR Premix Ex Taq为罗氏公司生产，DNA Marker、premix Taq Version、RNA反转录试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖购自景同晖有限公司。
1.3 主要仪器
超净工作台(苏州净化设备厂)
CO2细胞培养箱(NAPCO，USA)
离心机(北京医用离心机厂，LDS2A)
数码摄像机(pixerapro150Es，USA)
图象分析软件simplePCl(Compix，Inc，USA)
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