猪圆环病毒2型的分离和鉴定
猪圆环病毒2型（PCV2）属于圆环病毒科圆环病毒属，单股环状DNA病毒，目前已知的最小的病毒，在细胞核内增殖。PCV2能引起母猪繁殖障碍，断奶仔猪多系统衰竭综合征（PWMS）,猪皮炎和肾病综合征（PDNS）等疾病。PCV2单独感染时症状并不明显，但是会造成免疫抑制，从而继发感染其他病原，给养猪业造成巨大经济损失。本文通过收集南京周边猪场病死猪的肺和淋巴结，处理后提取DNA，进行普通PCR检测，检测为强阳性的病料，接入PK-15细胞进行病毒分离，连续传代10代，传代培养后用荧光定量PCR检测每一代。用间接免疫荧光（IFA）对PCV2做最终鉴定并检测半数组织细胞感染量（TCID50）。通过对PCV2的分离与鉴定，对PCV2的防控和流行有重要作用。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words: 3
引言 3
1材料与方法 4
1.1材料 4
1.1.1病料、细胞和病毒 4
1.1.2分子生物学试剂 5
1.1.3化学试剂 5
1.1.4细胞培养用生长液 5
2.1.5主要仪器 5
2.1.6实验室所用溶液的配制 5
2.1.7 PCV2特异性引物 5
1.2.1组织样品的采集与处理 5
1.2.2病毒核酸的提取 5
1.2.3组织样品中PCV2的PCR检测 6
1.2.4病毒的分离和鉴定 6
1.2.5荧光定量PCR检测 7
1.2.6间接免疫荧光试验和TCID50 7
2结果 7
2.1 PCV2的PCR检测结果 7
2.2病毒的分离和鉴定 8
2.3间接免疫荧光和TCID50结果 9
3讨论 10
致谢 11
参考文献............................................................................................................................ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
..............13
猪圆环病毒2型的分离与鉴定
引言
1982年德国科学家在猪肾细胞系PK15中发现第一个与动物有关的圆环病毒，此后命名为PCV1（Porcine circovirus 1）。较早的研究认为PCV对猪无致病性，但近年来从死产的仔猪分离到该病毒，表明可能并非如此。
1997年在法国首次分离道PCV2（Porcine circovirus 2）型与PCV1型抗原性有差异，存在于患僵猪综合征的仔猪，所致疾病称为断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome,PWMS）[1],PCV2感染还和母猪繁殖障碍、皮炎肾病综合征、呼吸道疾病有关，统称为猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirusassociated disease,PCVAD）。
圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，圆环病毒科于1995年确立，成员包括猪、禽及植物的圆环病毒，是已知最小的动植物病毒。病毒颗粒无囊膜，20面体对称，直径17nn。病毒颗粒常可见于感染细胞，以珍珠串样排列。基因组为单分子单股DNA，末端共价结合，为双向闭合环状结构[2]。PCV有PCV1、PCV2和PCV3三个基因型，PCV1无致病性，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系中，PCV2具有致病性，是本病的必须病原。PCV3是近几年新发现的病毒血清型，也造成猪的心血管系统的疾病及多系统的炎症全序列PCV1为1759nt，PCV2为17671nt或1798nt，PCV3为2000nt。PCV有两个主要阅读框，分别编码复制酶和衣壳蛋白。
圆环病毒在环境中极其稳定，对外界环境的抵抗力很强，耐酸，在PH3的环境下仍可以存活；耐氯仿；70℃环境中仍可以稳定存活15min。一般消毒剂很难将其杀灭，氯苯双胍己烷、福尔马林、碘酒和酒精室温作用下10min，可以部分杀灭病毒。
PCV2呈世界性流行，在我国也大范围流行，且PCV2在猪群中阴性感染的比例比较大，很难监控，导致了病原的扩散。除此之外，PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、细小病毒等混合感染[3, 4]，且在外观表现健康猪群仍存在PCV2 感染。
本病的发病率和死亡率变化很大，依猪群健康状况、饲养管理水平、环境条件及病毒类型等而定，病死率一般在10%—20%。本病无明显的季节性。
猪圆环病毒只感染家猪和野猪，未见有感染其他动物的报道。PCV2 作为一种常见的接触性传染病致病原，可在污染的水、饲料以及饲养环境中大量存在，可经呼吸道、消化道等多种途径感染各种日龄、各种品种的猪群发病，且PCV2 主要侵害猪的淋巴细胞，造成免疫抑制，因此导致PCV2 在短期内难以根除。妊娠母猪感染PCV2后，也可经胎盘垂直传播感染仔猪，引起繁殖障碍[5]。
PCV2感染后潜伏期较长，即或是胚胎期或出生后早期感染，也多在断乳以后才陆续出现临床症状，主要常见病症类型有：断乳仔猪多系统衰竭综合征（PWMS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道病综合征、PCV2相关性繁殖障碍、PCV2相关性肉芽肿性肠炎和PCV2相关性先天性震颤[68]。
实验室病毒检测方法主要有病毒分离鉴定、电镜检查、原位杂交、免疫组化技术和PCR等。其中，免疫组化技术和荧光抗体技术检测肺或淋巴结组织中PCV2抗原，敏感性高，特异性强，结果可靠。PCR比较快速、简便、特异，但操作时必须注意避免实验室污染，以免出现假阳性[9]。国外有时采用核酸探针检测PCV2。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病料、细胞和病毒
2017年9月来自江苏某猪场采集的肺组织。病猪有疑似PWMS的症状，死后剖检采集了肺脏，置70℃冰箱中保存。
PK15细胞由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室保存，PCV2参考毒株由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室分离和保存。
1.1.2分子生物学试剂
2×Premix Taq购自TaKaRa公司，柱式病毒DNA提取试剂盒购自Tiandz公司，DL2000 DNA marker 购自TsingKE公司，GoldViewTM Nucleic Acld strain购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；Rox Refence DyeⅡ 和2×Premix Taq购自TaKaRa公司，Taqman探针由江苏省农业科学院人兽共患病研究室提供。
1.1.3化学试剂
胰蛋白酶购自Gibico公司，抗PCV2阳性血清购自美国VMRD公司；FITC标记的兔抗猪荧光二抗购自武汉博士德公司。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words: 3
引言 3
1材料与方法 4
1.1材料 4
1.1.1病料、细胞和病毒 4
1.1.2分子生物学试剂 5
1.1.3化学试剂 5
1.1.4细胞培养用生长液 5
2.1.5主要仪器 5
2.1.6实验室所用溶液的配制 5
2.1.7 PCV2特异性引物 5
1.2.1组织样品的采集与处理 5
1.2.2病毒核酸的提取 5
1.2.3组织样品中PCV2的PCR检测 6
1.2.4病毒的分离和鉴定 6
1.2.5荧光定量PCR检测 7
1.2.6间接免疫荧光试验和TCID50 7
2结果 7
2.1 PCV2的PCR检测结果 7
2.2病毒的分离和鉴定 8
2.3间接免疫荧光和TCID50结果 9
3讨论 10
致谢 11
参考文献............................................................................................................................ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
..............13
猪圆环病毒2型的分离与鉴定
引言
1982年德国科学家在猪肾细胞系PK15中发现第一个与动物有关的圆环病毒，此后命名为PCV1（Porcine circovirus 1）。较早的研究认为PCV对猪无致病性，但近年来从死产的仔猪分离到该病毒，表明可能并非如此。
1997年在法国首次分离道PCV2（Porcine circovirus 2）型与PCV1型抗原性有差异，存在于患僵猪综合征的仔猪，所致疾病称为断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome,PWMS）[1],PCV2感染还和母猪繁殖障碍、皮炎肾病综合征、呼吸道疾病有关，统称为猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirusassociated disease,PCVAD）。
圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，圆环病毒科于1995年确立，成员包括猪、禽及植物的圆环病毒，是已知最小的动植物病毒。病毒颗粒无囊膜，20面体对称，直径17nn。病毒颗粒常可见于感染细胞，以珍珠串样排列。基因组为单分子单股DNA，末端共价结合，为双向闭合环状结构[2]。PCV有PCV1、PCV2和PCV3三个基因型，PCV1无致病性，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系中，PCV2具有致病性，是本病的必须病原。PCV3是近几年新发现的病毒血清型，也造成猪的心血管系统的疾病及多系统的炎症全序列PCV1为1759nt，PCV2为17671nt或1798nt，PCV3为2000nt。PCV有两个主要阅读框，分别编码复制酶和衣壳蛋白。
圆环病毒在环境中极其稳定，对外界环境的抵抗力很强，耐酸，在PH3的环境下仍可以存活；耐氯仿；70℃环境中仍可以稳定存活15min。一般消毒剂很难将其杀灭，氯苯双胍己烷、福尔马林、碘酒和酒精室温作用下10min，可以部分杀灭病毒。
PCV2呈世界性流行，在我国也大范围流行，且PCV2在猪群中阴性感染的比例比较大，很难监控，导致了病原的扩散。除此之外，PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、细小病毒等混合感染[3, 4]，且在外观表现健康猪群仍存在PCV2 感染。
本病的发病率和死亡率变化很大，依猪群健康状况、饲养管理水平、环境条件及病毒类型等而定，病死率一般在10%—20%。本病无明显的季节性。
猪圆环病毒只感染家猪和野猪，未见有感染其他动物的报道。PCV2 作为一种常见的接触性传染病致病原，可在污染的水、饲料以及饲养环境中大量存在，可经呼吸道、消化道等多种途径感染各种日龄、各种品种的猪群发病，且PCV2 主要侵害猪的淋巴细胞，造成免疫抑制，因此导致PCV2 在短期内难以根除。妊娠母猪感染PCV2后，也可经胎盘垂直传播感染仔猪，引起繁殖障碍[5]。
PCV2感染后潜伏期较长，即或是胚胎期或出生后早期感染，也多在断乳以后才陆续出现临床症状，主要常见病症类型有：断乳仔猪多系统衰竭综合征（PWMS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道病综合征、PCV2相关性繁殖障碍、PCV2相关性肉芽肿性肠炎和PCV2相关性先天性震颤[68]。
实验室病毒检测方法主要有病毒分离鉴定、电镜检查、原位杂交、免疫组化技术和PCR等。其中，免疫组化技术和荧光抗体技术检测肺或淋巴结组织中PCV2抗原，敏感性高，特异性强，结果可靠。PCR比较快速、简便、特异，但操作时必须注意避免实验室污染，以免出现假阳性[9]。国外有时采用核酸探针检测PCV2。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病料、细胞和病毒
2017年9月来自江苏某猪场采集的肺组织。病猪有疑似PWMS的症状，死后剖检采集了肺脏，置70℃冰箱中保存。
PK15细胞由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室保存，PCV2参考毒株由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室分离和保存。
1.1.2分子生物学试剂
2×Premix Taq购自TaKaRa公司，柱式病毒DNA提取试剂盒购自Tiandz公司，DL2000 DNA marker 购自TsingKE公司，GoldViewTM Nucleic Acld strain购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；Rox Refence DyeⅡ 和2×Premix Taq购自TaKaRa公司，Taqman探针由江苏省农业科学院人兽共患病研究室提供。
1.1.3化学试剂
胰蛋白酶购自Gibico公司，抗PCV2阳性血清购自美国VMRD公司；FITC标记的兔抗猪荧光二抗购自武汉博士德公司。
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