应用pcr方法对表观健康猪携带的猪链球菌的血清分型
本研究旨在了解江苏省海安县和常熟市的2个定点屠宰场一年内不同时期表观健康猪群携带猪链球菌的情况。共采集500份表观健康猪的扁桃体，增菌培养后用PCR方法进行谷氨酸脱氢酶基因（gdh）的鉴定，为阳性者再对其进行种型鉴定与基因测序。结果500份样品中101株为猪链球菌阳性，检出率为20.2%，最终确定血清型的有70株；其中致病性较强的1、2、7、9型无检出，3型5株、4型3株、5型3株、8型1株、12型3株、15型3株、16型7株、21型4株、23型1株、28型4株、29型2株、30型3株、31型31株。结果提示，江苏省屠宰的部分表观健康猪仍有携带猪链球菌的情况，且感染率最高的为31型。本研究可为猪链球菌病的流行病学调查及预防提供参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 菌株 2
1.2 主要试剂 2
1.3主要仪器2
1.4 样品来源与准备3
1.5 DNA提取3
1.6 猪链球菌种型鉴定3
1.6.1 引物的设计与合成3
1.6.2 PCR反应程序4
1.6.3 PCR产物检测5
1.7 测序5
1.7.1 胶回收5
1.7.2 连接T载体5
1.7.3 转化感受态细胞5
1.7.4 测序5
2 结果与分析5
2.1 猪链球菌检测及分型5
2.2 各血清型猪链球菌PCR产物测序8
3 讨论 9
致谢9
参考文献9
图1 单菌的PCR鉴定结果18
图2 单菌的PCR鉴定结果28
图3 单菌的PCR鉴定结果38
表1 猪链球菌分型检测所用引物及引物序列3
表2 各型PCR片段长度（bp）和退火温度4
表3 125份猪链球菌样品分型检测结果6
表4 500份送检样品中猪链球菌感染情况7
应用PCR方法对表观健康猪携带的猪链球 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
菌的血清分型
引言
猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起的不同临诊类型传染病的总称，是一种人畜共患病，常见的有败血性链球菌病和淋巴结脓肿两种类型[1]。荷兰的Jansen和vanDorssen[2]以及英国的Field[3]等最早报道链球菌感染猪。从那时起，猪链球菌病报道逐渐遍及全球传统养猪企业和现代集约化猪场。本病在我国最早由吴硕显报道，在上海郊区发现本病散发病例[4]。随着我国规模化养猪业的发展，猪链球菌病已成为养猪生产中的常见病和多发病，特别是近十多年来，其发病率不断升高，成为一些病毒性疾病的继发病，给我国养猪业造成了重大的经济损失，目前我国已将其法定为二类动物疫病[5]。
根据荚膜多糖抗原性的差异，猪链球菌可分为33个血清型[68]。对猪致病性较强的为猪链球菌1型、2型和9型，其中猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）最为常见，毒力最强，危害最严重[9]，而且可导致生猪从业人员感染和死亡[10]。1998年，我国江苏省爆发猪链球菌病，人感染猪链球菌病25例，其中死亡14例[11]。2005年四川省再次暴发由SS2引致的人及猪的链球菌病，引起了全世界的关注[12]。近几年又出现了猪链球菌14型和16型感染人的病例，同时发现在一些非疫区猪链球菌的检出率很高，并且分离到少见的猪链球菌16型[1314]。本次实验对江苏省2个屠宰场健康猪携带的猪链球菌的血清型情况进行调查，可以为该病的流行病学调查提供资料，并利于制定控制此病在猪猪、猪人之间感染的策略。
1 材料与方法
1．1 菌株
30个血清型的阳性质粒SS1、SS2、SS3、SS4、SS5、SS6、SS7、SS8、SS9、SS10、SS11、SS12、SS13、SS15、SS16、SS17、SS18、SS20、SS21、SS22、SS23、SS24、SS25、SS26、SS27、SS28、SS29、SS30、SS31、SS33均由广东海大畜牧兽医研究院惠赠。使用前将其复苏，即将200μL的携带阳性质粒的Trans5ɑ菌株接种于5ml/支的含Amp的 LB试管培养液中，37℃振荡过夜。
1．2 主要试剂
1．2．1 2×PCR Taq MasterMix购自ABM生物科技公司；DEPC处理水购自北京索莱宝科技有限公司；ddH2O由实验室自制。
1．2．2 50×TAE电泳缓冲液：
Tris 242g
Na2EDTA2H2O 37.2g
加入800ml ddH2O 搅拌、溶解
加入57.1ml醋酸
加ddH2O定容至1L
1×TAE，即琼脂糖凝胶电泳所用溶液：10ml 50×TAE+490ml ddH2O
1．2．3 1.2%琼脂糖凝胶：称取0.12g琼脂糖溶于100ml 1×TAE电泳缓冲液中，微波炉加热至完全融化，加入5μL EB，倒入制胶板，冷却后即可用。
1．2．4 AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司；Buffer
DEA为凝胶熔化剂，含DNA保护剂，可防止其在高温下降解；Buffer DEB为结合液，可促使大于70kp的DNA片段选择性结合到DNA制备膜上；Buffer W1为洗涤液；Buffer W2为去盐液，在使用前，要按试剂瓶指定体积加入无水乙醇，并混匀；Eluent为洗脱液。
1．2．5 pMD19T Vector Cloning Kit购自TaKaRa公司； DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
1．2．6 LB培养基：
Nacl 1%
胰蛋白胨 1%
酵母提取物 1%
LB琼脂平板则额外添加1.5%的琼脂粉。
1．3 主要仪器
台式高速离心机Centrifuge 5418购自艾本德中国有限公司；梯度PCR仪TP600购自TaKaRa公司；水平电泳槽DYCP31DN型购自北京市六一仪器厂；直流电泳仪DYY11型购自北京市六一仪器厂。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 菌株 2
1.2 主要试剂 2
1.3主要仪器2
1.4 样品来源与准备3
1.5 DNA提取3
1.6 猪链球菌种型鉴定3
1.6.1 引物的设计与合成3
1.6.2 PCR反应程序4
1.6.3 PCR产物检测5
1.7 测序5
1.7.1 胶回收5
1.7.2 连接T载体5
1.7.3 转化感受态细胞5
1.7.4 测序5
2 结果与分析5
2.1 猪链球菌检测及分型5
2.2 各血清型猪链球菌PCR产物测序8
3 讨论 9
致谢9
参考文献9
图1 单菌的PCR鉴定结果18
图2 单菌的PCR鉴定结果28
图3 单菌的PCR鉴定结果38
表1 猪链球菌分型检测所用引物及引物序列3
表2 各型PCR片段长度（bp）和退火温度4
表3 125份猪链球菌样品分型检测结果6
表4 500份送检样品中猪链球菌感染情况7
应用PCR方法对表观健康猪携带的猪链球 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
菌的血清分型
引言
猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起的不同临诊类型传染病的总称，是一种人畜共患病，常见的有败血性链球菌病和淋巴结脓肿两种类型[1]。荷兰的Jansen和vanDorssen[2]以及英国的Field[3]等最早报道链球菌感染猪。从那时起，猪链球菌病报道逐渐遍及全球传统养猪企业和现代集约化猪场。本病在我国最早由吴硕显报道，在上海郊区发现本病散发病例[4]。随着我国规模化养猪业的发展，猪链球菌病已成为养猪生产中的常见病和多发病，特别是近十多年来，其发病率不断升高，成为一些病毒性疾病的继发病，给我国养猪业造成了重大的经济损失，目前我国已将其法定为二类动物疫病[5]。
根据荚膜多糖抗原性的差异，猪链球菌可分为33个血清型[68]。对猪致病性较强的为猪链球菌1型、2型和9型，其中猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）最为常见，毒力最强，危害最严重[9]，而且可导致生猪从业人员感染和死亡[10]。1998年，我国江苏省爆发猪链球菌病，人感染猪链球菌病25例，其中死亡14例[11]。2005年四川省再次暴发由SS2引致的人及猪的链球菌病，引起了全世界的关注[12]。近几年又出现了猪链球菌14型和16型感染人的病例，同时发现在一些非疫区猪链球菌的检出率很高，并且分离到少见的猪链球菌16型[1314]。本次实验对江苏省2个屠宰场健康猪携带的猪链球菌的血清型情况进行调查，可以为该病的流行病学调查提供资料，并利于制定控制此病在猪猪、猪人之间感染的策略。
1 材料与方法
1．1 菌株
30个血清型的阳性质粒SS1、SS2、SS3、SS4、SS5、SS6、SS7、SS8、SS9、SS10、SS11、SS12、SS13、SS15、SS16、SS17、SS18、SS20、SS21、SS22、SS23、SS24、SS25、SS26、SS27、SS28、SS29、SS30、SS31、SS33均由广东海大畜牧兽医研究院惠赠。使用前将其复苏，即将200μL的携带阳性质粒的Trans5ɑ菌株接种于5ml/支的含Amp的 LB试管培养液中，37℃振荡过夜。
1．2 主要试剂
1．2．1 2×PCR Taq MasterMix购自ABM生物科技公司；DEPC处理水购自北京索莱宝科技有限公司；ddH2O由实验室自制。
1．2．2 50×TAE电泳缓冲液：
Tris 242g
Na2EDTA2H2O 37.2g
加入800ml ddH2O 搅拌、溶解
加入57.1ml醋酸
加ddH2O定容至1L
1×TAE，即琼脂糖凝胶电泳所用溶液：10ml 50×TAE+490ml ddH2O
1．2．3 1.2%琼脂糖凝胶：称取0.12g琼脂糖溶于100ml 1×TAE电泳缓冲液中，微波炉加热至完全融化，加入5μL EB，倒入制胶板，冷却后即可用。
1．2．4 AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司；Buffer
DEA为凝胶熔化剂，含DNA保护剂，可防止其在高温下降解；Buffer DEB为结合液，可促使大于70kp的DNA片段选择性结合到DNA制备膜上；Buffer W1为洗涤液；Buffer W2为去盐液，在使用前，要按试剂瓶指定体积加入无水乙醇，并混匀；Eluent为洗脱液。
1．2．5 pMD19T Vector Cloning Kit购自TaKaRa公司； DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
1．2．6 LB培养基：
Nacl 1%
胰蛋白胨 1%
酵母提取物 1%
LB琼脂平板则额外添加1.5%的琼脂粉。
1．3 主要仪器
台式高速离心机Centrifuge 5418购自艾本德中国有限公司；梯度PCR仪TP600购自TaKaRa公司；水平电泳槽DYCP31DN型购自北京市六一仪器厂；直流电泳仪DYY11型购自北京市六一仪器厂。
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