构建表达犬瘟热病毒h和n蛋白的重组马疱疹病毒1型bac
马疱疹病毒Rach株是已商品化的疫苗毒株，可作为通用载体或者基因治疗载体。本研究以马疱疹病毒Rach株的人工染色体克隆作为表达载体，应用Red两步法同源重组技术，以I-SceI归位内切酶作为同源重组酶无痕消除重组后的卡那霉素抗性标记基因，成功构建了Rach-H和Rach-N转移载体，用脂质体转染法将重组质粒Rach-H和Rach-N转染RK13细胞后拯救病毒，通过细胞病变和绿色荧光标记筛选，成功拯救出H-EHV和N-EHV两株重组病毒，经Western blot鉴定，H-EHV和N-EHV能分别表达H和N蛋白。该两株重组病毒的构建为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 细胞、病毒、菌株和中间载体2
1.1.2 酶与试剂2
1.1.3 试验设备2
1.2 方法 2
1.2.1 中间质粒的提取及目的片段的回收2
1.2.2 制备Rach 53感受态细胞并电转化3
1.2.3 转移载体RachH和RachN的构建3
1.2.4 PCR引物设计与合成及鉴定3
1.2.5 转移载体RachH和RachN质粒的提取4
1.2.6 转移载体RachH和RachN的转染、感染及病毒蛋白的提取4
1.2.7 Western blot检测H和N蛋白的表达5
2 结果与分析5
2.1 中间载体酶切电泳鉴定及Rach 53 PCR扩增结果5
2.1.1 中间载体酶切电泳鉴定5
2.1.2 Rach 53 PCR扩增结果6
2.2 重组转移载体RachH和RachN的鉴定6
2.3 重组转移载体RachH和RachN在RK13细胞中的转染及感染结果7
2.4 Western blot检测H和N蛋白的表达结果7 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
3 讨论8
致谢9
参考文献9
构建表达犬瘟热病毒H和N蛋白的重组马疱疹病毒1型BAC
引言
犬瘟热（Canine distemper，CD)是由副黏病毒科麻疹病毒属犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV) 引起的一种急性、高度接触性传染病[1]。该病呈世界性分布，感染宿主广泛，包括犬科、鼬科及浣熊科等科的多种动物，在物种间能够引起交叉感染且在不同动物中表现为不同的致死率[2,3]。其病原体CDV 为不分节段的单股负链 RNA 病毒，基因组呈线性排列，编码的蛋白主要有 N 、P、M、F、H 和 L 六种。其中N 蛋白（核衣壳蛋白）是麻疹病毒属中的主要交叉抗原，其分子量为58 kDa，具有包裹和保护内部基因的功能。H 蛋白（血凝素蛋白）是诱导机体产生中和抗体的重要抗原，分子量为76～85 kDa，为 CDV 囊膜表面 II 型糖蛋白，决定了 CDV 宿主的特异性，并协助 F 蛋白使 CDV 以囊膜与宿主细胞膜发生融合的方式进入宿主细胞。
马疱疹病毒1型（Equine herpes virus type 1，EHV1）属于疱疹病毒目，疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科水痘病毒属，是引起马呼吸道疾病，病毒性流产和神经性疾病的主要病原[4]。该病毒拥有庞大的双股DNA基因组，其中存在大量非必需基因，有大约30kbp的序列可以被外源基因取代，且不会严重影响病毒在体外细胞培养中增殖[5]，是构建病毒活载体疫苗的理想载体之一。
本研究通过应用Red两步法同源重组技术，构建了以马疱疹病毒Rach株为载体,将含犬瘟热病毒H或N基因的重组质粒经脂质体转染RK13细胞，获得了HEHV和NEHV的重组病毒，为研制安全有效、低成本的新型 CD 活病毒载体疫苗来防控CD 奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1.1 细胞、病毒、菌株和中间载体 RK13细胞、含特定内切酶的犬瘟热病毒H、N基因、携带绿色荧光蛋白基因的马疱疹病毒Rach 53菌株均由本实验室保存。中间载体puc19H、puc19N由南京钟鼎生物技术有限公司人员成功构建，含ICeuI酶切位点、与Rach 53一样的同源臂、cmv（启动子）、kana+和H/N基因。
1.1.2 酶与试剂 2×Vazyme LAmp Master Mix、DL5000 DNA Marker、1kb DNA Ladder等购自南京诺唯赞生物科技有限公司；ICeuI限制性内切酶为美国NEB公司产品；质粒小量提取试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；核酸胶回收试剂盒、质粒中量提取试剂盒和质粒大量提取试剂盒购自上海优宁维生物科技有限公司；MEM细胞培养液为Neuronbc 公司产品；胎牛血清为Invitrogen公司产品；十二烷基磺酸钠（SDS）、蛋白酶K、苯酚、氯仿、无水乙醇、甲基纤维素、NaHCO3、10%Na2Ac、胰酶等均为分析纯，购自Sigma公司。PEI储存液、电泳用试剂、氯霉素、卡那霉素、lysis buffe、mixture I和mixture II等自配。
1.1.3 试验设备 低温离心机、CO2细胞培养箱为Thermo Scientific公司产品；恒温振荡器购自太仓华利达实验室设备公司；Avanti JXN30智能型高效离心机购自贝克曼库尔特商贸有限公司；倒置显微镜为Olympus产品；电转仪、曝光机购自BioRad公司；PCR仪为Biometer及TaKaRa产品；荧光显微镜为ZEISS公司产品。
1．2 方法
1.2.1 中间质粒的提取及目的片段的回收
将puc19H、puc19N保存菌液按1:100分别接种于新的5ml LB中，并按1:1000加入卡那霉素，32℃、180rpm培养1216小时。用鼎国质粒快速提取试剂盒提取。具体操作步骤如下：用1.5 mL离心管收集5 mL菌液，于10000×g 离心1 min，弃去上清；将含有RNaseA的Solution I 250 μL加入上步离心管中，振荡重悬离心沉淀直至无菌块存在；在离心管中加入250 μL Solution II，温和颠倒混匀46次，至溶液清亮（不超过2 min）；在离心管中加入350 μL Solution III，马上颠倒混匀46次，直至白色沉淀形成，静置2 min；将混合溶液于13000×g 离心10 min；将离心管上清加入离心柱内，10000×g 离心1 min，弃去滤出的废液；在离心柱上加入500 μL Buffer HB，于10000×g离心1 min，弃去滤出的废液；在离心柱上加入700 μL含乙醇的DNA Wash Buffer，于10000×g离心1 min，弃去滤出的废液；继续加入700 μL含乙醇的DNA Wash Buffer，于10000×g离心1 min，弃去滤出的废液；于13000×g离心3min；将离心柱置于无菌1.5 mL离心管中，静置510 min；向离心柱吸附膜中央加入62℃预热的30 μL双蒸水，室温静置2 min，于13000×g离心1 min，管底沉淀即为所需质粒。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 细胞、病毒、菌株和中间载体2
1.1.2 酶与试剂2
1.1.3 试验设备2
1.2 方法 2
1.2.1 中间质粒的提取及目的片段的回收2
1.2.2 制备Rach 53感受态细胞并电转化3
1.2.3 转移载体RachH和RachN的构建3
1.2.4 PCR引物设计与合成及鉴定3
1.2.5 转移载体RachH和RachN质粒的提取4
1.2.6 转移载体RachH和RachN的转染、感染及病毒蛋白的提取4
1.2.7 Western blot检测H和N蛋白的表达5
2 结果与分析5
2.1 中间载体酶切电泳鉴定及Rach 53 PCR扩增结果5
2.1.1 中间载体酶切电泳鉴定5
2.1.2 Rach 53 PCR扩增结果6
2.2 重组转移载体RachH和RachN的鉴定6
2.3 重组转移载体RachH和RachN在RK13细胞中的转染及感染结果7
2.4 Western blot检测H和N蛋白的表达结果7 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
3 讨论8
致谢9
参考文献9
构建表达犬瘟热病毒H和N蛋白的重组马疱疹病毒1型BAC
引言
犬瘟热（Canine distemper，CD)是由副黏病毒科麻疹病毒属犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV) 引起的一种急性、高度接触性传染病[1]。该病呈世界性分布，感染宿主广泛，包括犬科、鼬科及浣熊科等科的多种动物，在物种间能够引起交叉感染且在不同动物中表现为不同的致死率[2,3]。其病原体CDV 为不分节段的单股负链 RNA 病毒，基因组呈线性排列，编码的蛋白主要有 N 、P、M、F、H 和 L 六种。其中N 蛋白（核衣壳蛋白）是麻疹病毒属中的主要交叉抗原，其分子量为58 kDa，具有包裹和保护内部基因的功能。H 蛋白（血凝素蛋白）是诱导机体产生中和抗体的重要抗原，分子量为76～85 kDa，为 CDV 囊膜表面 II 型糖蛋白，决定了 CDV 宿主的特异性，并协助 F 蛋白使 CDV 以囊膜与宿主细胞膜发生融合的方式进入宿主细胞。
马疱疹病毒1型（Equine herpes virus type 1，EHV1）属于疱疹病毒目，疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科水痘病毒属，是引起马呼吸道疾病，病毒性流产和神经性疾病的主要病原[4]。该病毒拥有庞大的双股DNA基因组，其中存在大量非必需基因，有大约30kbp的序列可以被外源基因取代，且不会严重影响病毒在体外细胞培养中增殖[5]，是构建病毒活载体疫苗的理想载体之一。
本研究通过应用Red两步法同源重组技术，构建了以马疱疹病毒Rach株为载体,将含犬瘟热病毒H或N基因的重组质粒经脂质体转染RK13细胞，获得了HEHV和NEHV的重组病毒，为研制安全有效、低成本的新型 CD 活病毒载体疫苗来防控CD 奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1.1 细胞、病毒、菌株和中间载体 RK13细胞、含特定内切酶的犬瘟热病毒H、N基因、携带绿色荧光蛋白基因的马疱疹病毒Rach 53菌株均由本实验室保存。中间载体puc19H、puc19N由南京钟鼎生物技术有限公司人员成功构建，含ICeuI酶切位点、与Rach 53一样的同源臂、cmv（启动子）、kana+和H/N基因。
1.1.2 酶与试剂 2×Vazyme LAmp Master Mix、DL5000 DNA Marker、1kb DNA Ladder等购自南京诺唯赞生物科技有限公司；ICeuI限制性内切酶为美国NEB公司产品；质粒小量提取试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；核酸胶回收试剂盒、质粒中量提取试剂盒和质粒大量提取试剂盒购自上海优宁维生物科技有限公司；MEM细胞培养液为Neuronbc 公司产品；胎牛血清为Invitrogen公司产品；十二烷基磺酸钠（SDS）、蛋白酶K、苯酚、氯仿、无水乙醇、甲基纤维素、NaHCO3、10%Na2Ac、胰酶等均为分析纯，购自Sigma公司。PEI储存液、电泳用试剂、氯霉素、卡那霉素、lysis buffe、mixture I和mixture II等自配。
1.1.3 试验设备 低温离心机、CO2细胞培养箱为Thermo Scientific公司产品；恒温振荡器购自太仓华利达实验室设备公司；Avanti JXN30智能型高效离心机购自贝克曼库尔特商贸有限公司；倒置显微镜为Olympus产品；电转仪、曝光机购自BioRad公司；PCR仪为Biometer及TaKaRa产品；荧光显微镜为ZEISS公司产品。
1．2 方法
1.2.1 中间质粒的提取及目的片段的回收
将puc19H、puc19N保存菌液按1:100分别接种于新的5ml LB中，并按1:1000加入卡那霉素，32℃、180rpm培养1216小时。用鼎国质粒快速提取试剂盒提取。具体操作步骤如下：用1.5 mL离心管收集5 mL菌液，于10000×g 离心1 min，弃去上清；将含有RNaseA的Solution I 250 μL加入上步离心管中，振荡重悬离心沉淀直至无菌块存在；在离心管中加入250 μL Solution II，温和颠倒混匀46次，至溶液清亮（不超过2 min）；在离心管中加入350 μL Solution III，马上颠倒混匀46次，直至白色沉淀形成，静置2 min；将混合溶液于13000×g 离心10 min；将离心管上清加入离心柱内，10000×g 离心1 min，弃去滤出的废液；在离心柱上加入500 μL Buffer HB，于10000×g离心1 min，弃去滤出的废液；在离心柱上加入700 μL含乙醇的DNA Wash Buffer，于10000×g离心1 min，弃去滤出的废液；继续加入700 μL含乙醇的DNA Wash Buffer，于10000×g离心1 min，弃去滤出的废液；于13000×g离心3min；将离心柱置于无菌1.5 mL离心管中，静置510 min；向离心柱吸附膜中央加入62℃预热的30 μL双蒸水，室温静置2 min，于13000×g离心1 min，管底沉淀即为所需质粒。
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