三株猪源菊粉酶产生菌益生特性的体外评价
本研究以从猪肠道中分离纯化的三株菊粉酶产生菌（J1、J2和J3）作为研究对象，体外评价其耐高温、耐胃酸、耐胆盐、耐胰酶等益生特性，以及菊粉酶活性和菊粉降解率，为其后续的开发利用提供参考依据。研究结果显示，J1和J3菌株相比，J2菌株增殖速度快，稳定期持续时间长，并且J2菊粉酶活性和菊粉降解率均显著高于J1和J3（P<0.05）。J3对45℃-65℃具有一定耐受性。J2和J3能耐受pH值大于4.5的仔猪胃环境。三株菌同时能耐受小肠中的胆盐浓度和胰蛋白酶的水解作用。因此，J2菌株具备开发为微生态制剂的潜力。然而，J2菌株不能耐受pH低于3.5的仔猪胃环境，且耐高温能力较差，对其的开发利用还需进行更多的深入研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料2
1.1.1 菌种2
1.1.2 主要试剂2
1.1.3 主要仪器2
1.1.4 培养基的配制2
1.2 生长曲线的测定2
1.3 菊粉含量及菊粉降解率的测定3
1.3.1 总糖含量的测定3
1.3.2 还原糖含量的测定3
1.4 菊粉酶活性的测定3
1.5 菌株耐受性试验3
1.5.1 耐热性试验3
1.5.2 胃蛋白酶盐酸耐受性试验3
1.5.3 胰蛋白酶耐受性试验4
1.5.4 胆汁耐受性试验4
1.6 统计分析4
2 结果与分析4
2.1 三株菌的生长曲线4
2.2 三株菌生长24 h前后总糖、还原糖、菊粉含量及菊粉降解率4
2.3 三株菌的菊粉酶活性5
2.4 三株菌的耐热性试验结果6
2.5 三株菌的胃蛋白酶盐酸耐受性试验结果7
2.6 三株菌的胰蛋白酶耐受性试验结果8
2.7 三株菌的胆汁耐受性试验结果10
3 讨论11
致谢13< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
br /> 参考文献13
三株猪源菊粉酶产生菌益生特性的体外评价
引言
菊粉（Inulin）主要存在于菊芋、菊苣等菊科植物中，主要成分由果糖残基（F）以β2,1糖苷键连接而成的线性直链多糖（果聚糖），末端连有一个葡萄糖残基（G），分子量大小3 000～5 000 u[1, 2]。有研究发现，日粮中添加2%水平的菊粉能够有效调节仔猪生长相关激素水平，改善肠道健康，提高机体免疫功能、营养的消化与吸收，以及能量代谢，同时能够减缓应激、降低腹泻率[3]，表明菊粉对机体具有益生效应。在单胃动物（如小鼠、猪等）和人中，由于胃肠内不能分泌分解菊粉的β果糖苷酶[4, 5]，仅胃酸或其他某些酸性溶液能部分水解菊粉[6]。因此，绝大部分菊粉进入大肠，被大肠内的微生物发酵利用[7]。前人大量研究发现，在单胃动物和人中，菊粉在大肠内被微生物，如双歧杆菌属（Bifidobacterium）和乳酸菌属（Lactobacillus）内的细菌利用产生大量的短链脂肪酸（short chain fatty acids, SCFA）[79]。SCFA，包括乙酸、丙酸和丁酸，一方面能够调节肠道黏膜免疫、营养吸收，另一方面可为肠道上皮细胞（尤其是结肠细胞）供能[10]。菊粉被微生物利用产生的终产物不仅有SCFA，还有有机酸（如乳酸、丙酮酸等）、气体（CO2、H2、CH4、H2S等）[11, 12]。然而，有研究发现双歧杆菌属（Bifidobacterium）和乳酸菌属（Lactobacillus）不能产生H2和H2S，因而推测大肠内存在其他属的细菌可以利用菊粉，同时，有研究发现，链球菌属（Streptococcus）内的某些细菌具有产生菊粉酶的能力[13]。在含有菊粉的日粮中添加动物源菊粉酶产生菌，将有助于菊粉在大肠内的分解，使其更好地发挥益生作用。
将菊粉酶产生菌作为微生物制剂用于实践生产需要考虑的问题较多，包括菌种筛选、菌的活性、生产工艺、保存及运输条件等。菊粉酶主要通过内切酶能将菊粉分解为菊粉三糖、菊粉四糖等为主的菊粉寡糖[14]，进而发挥益生作用。因此，菊粉内切酶的活性是菊粉酶产生菌菌种筛选的重要指标之一。此外，日粮中添加的菊粉酶产生菌能否适应动物肠道内环境，如胃酸、胆盐、肠道原著菌群竞争等，还有待进一步验证。目前，关于体外评价猪源益生菌益生特性的研究主要以乳酸菌株和芽孢杆菌为主。王志林[15]等对从仔猪粪便中分离的106株乳酸菌进行抗逆性（pH值2.5和0.3%胆盐）筛选，获得16株耐酸、耐胆盐的候选菌株，其中LR1菌株耐酸耐胆盐能力优于其它菌株。孙宏[16]等以仔猪粪便为样品，分离出6株具有溶钙能力和对肠道致病菌有较强抑制性能的细菌，经过耐酸、耐胆盐、细胞粘附和抑菌等试验后，筛选得到一株具有良好益生特性的乳酸菌株。宁豫昌等[17]从猪肠道中分离到13株芽孢杆菌，对这13株芽孢杆菌分别进行了耐酸性试验、耐胆盐试验、体外抑菌试验和动物安全性试验，发现其中一株地衣芽孢杆菌B7株和一株枯草芽孢杆菌B9株均有较强的耐酸、耐胆盐能力,对致病性大肠杆菌具有较好的体外抑制能力，且均安全无毒。然而，目前有关评价猪源菊粉酶产生菌益生特性的研究较少，因此本文以从猪肠道中筛选，并经过16S rDNA鉴定的三株菊粉酶产生菌为研究对象，评价它们的耐高温、耐胃酸、耐胆盐、耐胰酶等益生特性，以及菊粉酶活性，为它们后续的开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种 本试验所用菌株J1、J2和J3来自于本实验室之前从猪的盲肠和结肠食糜中分离出的菊粉酶产生菌。将三株菌的16S rDNA测序结果经NCBI blast比对进行同源性分析，J1与Streptococcus gallolyticus的同源性为99%，J2与Streptococcus lutetiensis的同源性为99%，J3与Streptococcus equinus的同源性为99%
1.1.2 主要试剂 本试验用的菊粉（高纯）、胆酸钠（猪）、胰蛋白酶（猪）、胃蛋白酶（猪胃粘膜）均采购于源叶生物公司。
1.1.3 主要仪器 隔水式恒温培养箱、恒温三用水箱、超净工作台、无菌注射器、超速冷冻离心机、分光光度计。
1.1.4 培养基的配制 参照张京[18]的方法，稍做改良，每1 L培养基中加入：酪蛋白胨10 g，酵母浸膏2.5 g，菊粉5 g，液体乳酸钠5 g，碳酸氢钠4 g，半胱氨酸盐酸盐0.5 g，韧天青1 mL，离心瘤胃上清液200 mL，A溶液150 mL，B溶液150 mL。CO2通气610 h，直至溶液变为浅黄色。在持续CO2气流通气的条件下，将培养基分装到滚管中，每管9 mL，用橡胶塞密封，打盖，115℃灭菌20 min。A溶液配制方法：将3 g K2HPO4溶于1 L煮沸过的去离子水中。B溶液配制方法：将0.6 g CaCl2，3 g KH2PO4，6 g NaCl，6 g (NH4)2SO4，6 g MgSO4?7H2O溶于1 L煮沸过的去离子水中。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料2
1.1.1 菌种2
1.1.2 主要试剂2
1.1.3 主要仪器2
1.1.4 培养基的配制2
1.2 生长曲线的测定2
1.3 菊粉含量及菊粉降解率的测定3
1.3.1 总糖含量的测定3
1.3.2 还原糖含量的测定3
1.4 菊粉酶活性的测定3
1.5 菌株耐受性试验3
1.5.1 耐热性试验3
1.5.2 胃蛋白酶盐酸耐受性试验3
1.5.3 胰蛋白酶耐受性试验4
1.5.4 胆汁耐受性试验4
1.6 统计分析4
2 结果与分析4
2.1 三株菌的生长曲线4
2.2 三株菌生长24 h前后总糖、还原糖、菊粉含量及菊粉降解率4
2.3 三株菌的菊粉酶活性5
2.4 三株菌的耐热性试验结果6
2.5 三株菌的胃蛋白酶盐酸耐受性试验结果7
2.6 三株菌的胰蛋白酶耐受性试验结果8
2.7 三株菌的胆汁耐受性试验结果10
3 讨论11
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br /> 参考文献13
三株猪源菊粉酶产生菌益生特性的体外评价
引言
菊粉（Inulin）主要存在于菊芋、菊苣等菊科植物中，主要成分由果糖残基（F）以β2,1糖苷键连接而成的线性直链多糖（果聚糖），末端连有一个葡萄糖残基（G），分子量大小3 000～5 000 u[1, 2]。有研究发现，日粮中添加2%水平的菊粉能够有效调节仔猪生长相关激素水平，改善肠道健康，提高机体免疫功能、营养的消化与吸收，以及能量代谢，同时能够减缓应激、降低腹泻率[3]，表明菊粉对机体具有益生效应。在单胃动物（如小鼠、猪等）和人中，由于胃肠内不能分泌分解菊粉的β果糖苷酶[4, 5]，仅胃酸或其他某些酸性溶液能部分水解菊粉[6]。因此，绝大部分菊粉进入大肠，被大肠内的微生物发酵利用[7]。前人大量研究发现，在单胃动物和人中，菊粉在大肠内被微生物，如双歧杆菌属（Bifidobacterium）和乳酸菌属（Lactobacillus）内的细菌利用产生大量的短链脂肪酸（short chain fatty acids, SCFA）[79]。SCFA，包括乙酸、丙酸和丁酸，一方面能够调节肠道黏膜免疫、营养吸收，另一方面可为肠道上皮细胞（尤其是结肠细胞）供能[10]。菊粉被微生物利用产生的终产物不仅有SCFA，还有有机酸（如乳酸、丙酮酸等）、气体（CO2、H2、CH4、H2S等）[11, 12]。然而，有研究发现双歧杆菌属（Bifidobacterium）和乳酸菌属（Lactobacillus）不能产生H2和H2S，因而推测大肠内存在其他属的细菌可以利用菊粉，同时，有研究发现，链球菌属（Streptococcus）内的某些细菌具有产生菊粉酶的能力[13]。在含有菊粉的日粮中添加动物源菊粉酶产生菌，将有助于菊粉在大肠内的分解，使其更好地发挥益生作用。
将菊粉酶产生菌作为微生物制剂用于实践生产需要考虑的问题较多，包括菌种筛选、菌的活性、生产工艺、保存及运输条件等。菊粉酶主要通过内切酶能将菊粉分解为菊粉三糖、菊粉四糖等为主的菊粉寡糖[14]，进而发挥益生作用。因此，菊粉内切酶的活性是菊粉酶产生菌菌种筛选的重要指标之一。此外，日粮中添加的菊粉酶产生菌能否适应动物肠道内环境，如胃酸、胆盐、肠道原著菌群竞争等，还有待进一步验证。目前，关于体外评价猪源益生菌益生特性的研究主要以乳酸菌株和芽孢杆菌为主。王志林[15]等对从仔猪粪便中分离的106株乳酸菌进行抗逆性（pH值2.5和0.3%胆盐）筛选，获得16株耐酸、耐胆盐的候选菌株，其中LR1菌株耐酸耐胆盐能力优于其它菌株。孙宏[16]等以仔猪粪便为样品，分离出6株具有溶钙能力和对肠道致病菌有较强抑制性能的细菌，经过耐酸、耐胆盐、细胞粘附和抑菌等试验后，筛选得到一株具有良好益生特性的乳酸菌株。宁豫昌等[17]从猪肠道中分离到13株芽孢杆菌，对这13株芽孢杆菌分别进行了耐酸性试验、耐胆盐试验、体外抑菌试验和动物安全性试验，发现其中一株地衣芽孢杆菌B7株和一株枯草芽孢杆菌B9株均有较强的耐酸、耐胆盐能力,对致病性大肠杆菌具有较好的体外抑制能力，且均安全无毒。然而，目前有关评价猪源菊粉酶产生菌益生特性的研究较少，因此本文以从猪肠道中筛选，并经过16S rDNA鉴定的三株菊粉酶产生菌为研究对象，评价它们的耐高温、耐胃酸、耐胆盐、耐胰酶等益生特性，以及菊粉酶活性，为它们后续的开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种 本试验所用菌株J1、J2和J3来自于本实验室之前从猪的盲肠和结肠食糜中分离出的菊粉酶产生菌。将三株菌的16S rDNA测序结果经NCBI blast比对进行同源性分析，J1与Streptococcus gallolyticus的同源性为99%，J2与Streptococcus lutetiensis的同源性为99%，J3与Streptococcus equinus的同源性为99%
1.1.2 主要试剂 本试验用的菊粉（高纯）、胆酸钠（猪）、胰蛋白酶（猪）、胃蛋白酶（猪胃粘膜）均采购于源叶生物公司。
1.1.3 主要仪器 隔水式恒温培养箱、恒温三用水箱、超净工作台、无菌注射器、超速冷冻离心机、分光光度计。
1.1.4 培养基的配制 参照张京[18]的方法，稍做改良，每1 L培养基中加入：酪蛋白胨10 g，酵母浸膏2.5 g，菊粉5 g，液体乳酸钠5 g，碳酸氢钠4 g，半胱氨酸盐酸盐0.5 g，韧天青1 mL，离心瘤胃上清液200 mL，A溶液150 mL，B溶液150 mL。CO2通气610 h，直至溶液变为浅黄色。在持续CO2气流通气的条件下，将培养基分装到滚管中，每管9 mL，用橡胶塞密封，打盖，115℃灭菌20 min。A溶液配制方法：将3 g K2HPO4溶于1 L煮沸过的去离子水中。B溶液配制方法：将0.6 g CaCl2，3 g KH2PO4，6 g NaCl，6 g (NH4)2SO4，6 g MgSO4?7H2O溶于1 L煮沸过的去离子水中。
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