chemerin对牛肌内前体脂肪细胞分化和pparγ表达的影响
目的分析Chemerin对成牛肌内前体脂肪细胞分化的作用及机制，以及分化过程中PPARγ表达的影响。方法使用“天花板”培养法培养，得到牛肌内前体脂肪细胞。加入分化诱导液，采用油红O 染色观察脂肪细胞分化及脂质聚集情况，进行甘油三酯（TG）含量检测，并应用qRT-PCR及免疫印迹技术检测细胞中PPARγ的mRNA和蛋白的表达情况。结果经Chemerin诱导分化8后，实验组比对照组脂滴含量增加，TG含量明显升高（p<0.01），PPARγ的mRNA和蛋白表达水平显著升高。结论Chemerin能够促进牛肌内前体脂肪的分化。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 牛肌内前体脂肪细胞的获取及处理2
1.2.2 油红O细胞化学染色2
1.2.3 甘油三酯测定2
1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应(qRTPCR)2
1.2.5 免疫印迹3
2 结果3
2.1 牛前体脂肪细胞诱导分化不同阶段油红O染色结果3
2.2 甘油三酯（TG）含量检测结果3
2.3 实时荧光定量聚合酶链反应检测PPARγmRNA的表达4
2.4 Western blot检测PPARγ蛋白的表达4
3 讨论 5
致谢5
参考文献6
Chemerin对牛肌内前体脂肪分化和PPARγ表达的影响
引言
随着人们对肉品质要求的不断提高，安全优质肉产品生产成为畜牧业亟需解决的重要问题，如何提高肉质已成为当今畜牧业的研究热点[1]。肌内脂肪含量是评定肌肉品质的主要指标之一，直接影响牛肉的嫩度、多汁性，特别是牛肉的适口性[2]。近来的研究发现Chemerin是一种脂肪因子，能够对于脂肪细胞的分化、脂解起到调节作用，表达程度与肥胖有关，增强脂肪细胞内胰岛素的信号传导途径等生物学效应[3]。但大多数的研究对象都是人，猪等哺乳动物，对于反刍动物还未有深入
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
的研究。因此本文拟以成牛肌内前体脂肪细胞为试验原料，分析Chemerin蛋白对肌内前体脂肪细胞分化的作用及脂肪关键因子PPARγ表达的影响，为深入探讨肌内脂肪特异性沉积的调控机制，增加成牛肌内脂肪的含量、改善肉质量提供理论依据。
材料与方法
1.1材料
肌内脂肪获得于牛背最长肌肉内。Chemerin（2325CM025）购于R&D公司，并溶解于含有0.1%的牛血清白蛋白的PBS中，母液被稀释为100μg/mL，过滤杀菌，保存于20℃。高糖DMEM培养基购自Hyclone公司、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）购于浙江天杭生物科技有限公司；脂肪细胞分化诱导液（Cyagen Biosciences Inc）、甘油三酯测定试剂盒购于南京建成生物研究所；Trizol试剂购自Invitrogen公司、PrimeScriptTM RT Master Mix（TaKaRa）、SYBR Premix Ex TaqTM II（TaKaRa）；Ι型胶原酶（Sigma）；PPARγ多抗（Santa公司）、βactin抗体（CST公司）。
1.2方法
1.2.1牛肌内前体脂肪细胞的获取及处理
无菌条件下，取牛脂肪组织，采用“天花板”培养法培养。用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化1h, 消化后的混和液依次过100μm、70μm孔径的无菌细胞筛；收集滤液，离心5 min (1 000r/min);取得上清液，加入合适无血清培养基进行稀释洗涤，离心5 min (500 r/min)；在25cm2 培养瓶中加入500μl(4×105)上层离心液(此培养瓶预先灌满含10 %胎牛血清的DMEM F12 的培养基, 在37 ℃、5%CO2培养箱中静止培养4～ 6h，使培养瓶内保持均衡)，移去瓶内所有气泡；将瓶盖盖好,颠倒放置培养瓶(凸面朝上)并使其保持水平， 培养于37℃、5%CO2的培养箱中。由于浮力小，成熟脂肪细胞将漂浮贴壁到“天花板”面。大概两周后，脂肪细胞会完全去分化为前体脂肪细胞。将细胞分为Chemerin（0.1μg/ml）处理组和空白组。加入分化诱导液，诱导8天。
1.2.2油红O 细胞化学染色
肌内前体脂肪细胞分化8天后，使用PBS洗涤细胞2次，用10%甲醛固定30min，PBS再次洗2次后，用0.5%油红O染色20min，PBS洗1次，于显微镜下观察细胞内脂质呈红色。
1.2.3甘油三酯测定
牛肌内前体脂肪细胞分化8天后，收集细胞，用细胞破碎仪破碎，利用甘油三酯试剂盒进行测定。
1.2.4实时荧光定量聚合酶链反应(qRTPCR)
肌内前体脂肪细胞分化8天后，收集细胞，用Trizol核酸提取试剂盒提取各组细胞中总RNA ，超微量分光光度计测定RNA纯度和浓度。采用Takala试剂盒进行反转录。引物序列（见table1）。采用 SYBR green 法检测RNA的表达水平。反应体系：SYBR Greenl10 ul，上游引物(l0 uM)0.4ul，下游引物(l0uM)0.4ul，cDNA2ul，补充ddH20水至20ul。反应条件：95℃变性2 min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃复性延伸1min，40个循环。反应产物经溶解曲线检测特异性。经SDS2.2软件分析循环阈值（CT值）。
Table 1 Primer sequences for RTqPCR
Gene
Forward (5’3’)
Reverse (5’3’)
PPARγ
ATCTGCTGCAAGCCTTGGA
TGGAGCAGCTTGGCAAAGA
βactin
ACCACACCTTCTACAACGAG
GAACATGATCTGGGTCATCTTC
1.2.5免疫印迹
收集细胞，加入含PMSF的裂解液提取细胞总蛋白。用BCA法测定蛋白浓度，调整总蛋白浓度后，按1∶4加入 5×上样缓冲液，煮沸10min，用预制胶进行电泳分离，电泳完毕后电转移到硝酸纤维素膜上，用 5%脱脂牛奶室温封闭 1 h，一抗（1:1000）4℃孵育过夜，二抗（1:2000）孵育1h，最后用化学发光法显示结果，用Image J分析进行条带的灰度分析。
结果
2.1牛前体脂肪细胞诱导分化不同阶段油红O染色结果
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 牛肌内前体脂肪细胞的获取及处理2
1.2.2 油红O细胞化学染色2
1.2.3 甘油三酯测定2
1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应(qRTPCR)2
1.2.5 免疫印迹3
2 结果3
2.1 牛前体脂肪细胞诱导分化不同阶段油红O染色结果3
2.2 甘油三酯（TG）含量检测结果3
2.3 实时荧光定量聚合酶链反应检测PPARγmRNA的表达4
2.4 Western blot检测PPARγ蛋白的表达4
3 讨论 5
致谢5
参考文献6
Chemerin对牛肌内前体脂肪分化和PPARγ表达的影响
引言
随着人们对肉品质要求的不断提高，安全优质肉产品生产成为畜牧业亟需解决的重要问题，如何提高肉质已成为当今畜牧业的研究热点[1]。肌内脂肪含量是评定肌肉品质的主要指标之一，直接影响牛肉的嫩度、多汁性，特别是牛肉的适口性[2]。近来的研究发现Chemerin是一种脂肪因子，能够对于脂肪细胞的分化、脂解起到调节作用，表达程度与肥胖有关，增强脂肪细胞内胰岛素的信号传导途径等生物学效应[3]。但大多数的研究对象都是人，猪等哺乳动物，对于反刍动物还未有深入
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
的研究。因此本文拟以成牛肌内前体脂肪细胞为试验原料，分析Chemerin蛋白对肌内前体脂肪细胞分化的作用及脂肪关键因子PPARγ表达的影响，为深入探讨肌内脂肪特异性沉积的调控机制，增加成牛肌内脂肪的含量、改善肉质量提供理论依据。
材料与方法
1.1材料
肌内脂肪获得于牛背最长肌肉内。Chemerin（2325CM025）购于R&D公司，并溶解于含有0.1%的牛血清白蛋白的PBS中，母液被稀释为100μg/mL，过滤杀菌，保存于20℃。高糖DMEM培养基购自Hyclone公司、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）购于浙江天杭生物科技有限公司；脂肪细胞分化诱导液（Cyagen Biosciences Inc）、甘油三酯测定试剂盒购于南京建成生物研究所；Trizol试剂购自Invitrogen公司、PrimeScriptTM RT Master Mix（TaKaRa）、SYBR Premix Ex TaqTM II（TaKaRa）；Ι型胶原酶（Sigma）；PPARγ多抗（Santa公司）、βactin抗体（CST公司）。
1.2方法
1.2.1牛肌内前体脂肪细胞的获取及处理
无菌条件下，取牛脂肪组织，采用“天花板”培养法培养。用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化1h, 消化后的混和液依次过100μm、70μm孔径的无菌细胞筛；收集滤液，离心5 min (1 000r/min);取得上清液，加入合适无血清培养基进行稀释洗涤，离心5 min (500 r/min)；在25cm2 培养瓶中加入500μl(4×105)上层离心液(此培养瓶预先灌满含10 %胎牛血清的DMEM F12 的培养基, 在37 ℃、5%CO2培养箱中静止培养4～ 6h，使培养瓶内保持均衡)，移去瓶内所有气泡；将瓶盖盖好,颠倒放置培养瓶(凸面朝上)并使其保持水平， 培养于37℃、5%CO2的培养箱中。由于浮力小，成熟脂肪细胞将漂浮贴壁到“天花板”面。大概两周后，脂肪细胞会完全去分化为前体脂肪细胞。将细胞分为Chemerin（0.1μg/ml）处理组和空白组。加入分化诱导液，诱导8天。
1.2.2油红O 细胞化学染色
肌内前体脂肪细胞分化8天后，使用PBS洗涤细胞2次，用10%甲醛固定30min，PBS再次洗2次后，用0.5%油红O染色20min，PBS洗1次，于显微镜下观察细胞内脂质呈红色。
1.2.3甘油三酯测定
牛肌内前体脂肪细胞分化8天后，收集细胞，用细胞破碎仪破碎，利用甘油三酯试剂盒进行测定。
1.2.4实时荧光定量聚合酶链反应(qRTPCR)
肌内前体脂肪细胞分化8天后，收集细胞，用Trizol核酸提取试剂盒提取各组细胞中总RNA ，超微量分光光度计测定RNA纯度和浓度。采用Takala试剂盒进行反转录。引物序列（见table1）。采用 SYBR green 法检测RNA的表达水平。反应体系：SYBR Greenl10 ul，上游引物(l0 uM)0.4ul，下游引物(l0uM)0.4ul，cDNA2ul，补充ddH20水至20ul。反应条件：95℃变性2 min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃复性延伸1min，40个循环。反应产物经溶解曲线检测特异性。经SDS2.2软件分析循环阈值（CT值）。
Table 1 Primer sequences for RTqPCR
Gene
Forward (5’3’)
Reverse (5’3’)
PPARγ
ATCTGCTGCAAGCCTTGGA
TGGAGCAGCTTGGCAAAGA
βactin
ACCACACCTTCTACAACGAG
GAACATGATCTGGGTCATCTTC
1.2.5免疫印迹
收集细胞，加入含PMSF的裂解液提取细胞总蛋白。用BCA法测定蛋白浓度，调整总蛋白浓度后，按1∶4加入 5×上样缓冲液，煮沸10min，用预制胶进行电泳分离，电泳完毕后电转移到硝酸纤维素膜上，用 5%脱脂牛奶室温封闭 1 h，一抗（1:1000）4℃孵育过夜，二抗（1:2000）孵育1h，最后用化学发光法显示结果，用Image J分析进行条带的灰度分析。
结果
2.1牛前体脂肪细胞诱导分化不同阶段油红O染色结果
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