鸡蛋中粘蛋白的制备及含量测定(附件)
摘 要 本论文从蛋清中提取分离纯化得到了卵类粘蛋白，并对其进行了含量测定和活性检测。 本论文使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质的含量，以牛血清蛋白为标准蛋白质，建立了蛋白质含量测定的紫外可见分光光度法方法学，此方法线性良好，回收率等都符合要求。采用三氯乙酸-丙酮法进行粘蛋白的提取分离分离，经过SephadexG-25层析柱脱盐，使用DEAE-32纤维素精细纯化和透析纯化的方法制备了精制粘蛋白。从50 mL蛋清中可获得粘蛋白样品重约为300 mg，粘蛋白的含量为92.5%。Keywords:Mucin;The extraction separation and purification; Active detection; Content determination. 目 录
1 前言
1.1 粘蛋白的研究现状 1
1.2 卵类粘蛋白的理化性质 2
1.3 提取分离纯化方法 2
1.4 论文研究的意义 3
2 粘蛋白含量测定的方法学建立
2.1 仪器与试剂 4
2.1.1 仪器 4
2.1.2 试剂 4
2.2.1 与实验相关溶液的配制 5
2.2.2 标准曲线的绘制 5
2.2.3 稳定性试验 6
2.2.4 精密度试验 6
2.2.5 回收率试验 6
2.3 小结 7
3 粘蛋白的制备及活性测定
3.1 材料与仪器 8
3.2 溶液配制及填料处理 8
3.3 技术路线 9
3.4 鸡蛋中粘蛋白的提取 9
3.5 粘蛋白的分离 10
3.5.1 冷丙酮沉淀粘蛋白粗品 10
3.5.2 去除残留丙酮试剂 10
3.6 粘蛋白的纯化 10
3.6.1 Sephadex G25层析柱脱盐 10
3.6.2 DAEE纤维素离子交换法除杂质蛋白 10
3.6.3 透析除盐 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
的提取 9
3.5 粘蛋白的分离 10
3.5.1 冷丙酮沉淀粘蛋白粗品 10
3.5.2 去除残留丙酮试剂 10
3.6 粘蛋白的纯化 10
3.6.1 Sephadex G25层析柱脱盐 10
3.6.2 DAEE纤维素离子交换法除杂质蛋白 10
3.6.3 透析除盐 11
3.7 含量测定 11
3.8 活性检测 12
3.8.1 实验所需试剂 12
3.8.2 检测方法 12
3.8.4 实验结果 13
3.9 小结 14
全文总结 16
参考文献 17
致 谢 19
1 前言
粘蛋白是生物体防御体系内很重要的组成部分，或者说是不可或缺的一部分，因为它是生物抵抗外界防御的基础[1]。然而几乎所有粘蛋白目前己知的功能均是在哺乳动物中发现的，对禽蛋中粘蛋白的研究相对较少。粘蛋白是一类髙分子量的硫酸酯糖蛋白，主要存在于蛋清浓厚蛋白中，这种蛋白质呈纤维状，在溶液中具有较高的粘性，有维持蛋清浓厚蛋白组成及抑制滤过性病毒的血球凝集反应等作用，同时对维持蛋清的凝胶特性以及起泡稳定性也具有重要的作用。最近的研究表明粘蛋白还具有抗菌[2]、抗病毒、抑制肿瘤细胞的增殖以及降低血清胆固醇等多种生物活性，不仅具有生物学意义，而且具有重要的医学、营养学和保健方面的研究价值[3]。同蛋清中的其它主要蛋白质如卵白蛋白、溶菌酶等相比，目前关于粘蛋白的研究很少。本论文就粘蛋白的提取、分离、纯化和活性测定做初步研究。
鸡卵类粘蛋白具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用[4]，胰蛋白酶能水解酯键，酰胺键和肽键，利用这一性质用人工合成的底物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的活力，由此可计算卵类粘蛋白的活力。
1.1 粘蛋白的研究现状
鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，根据研究它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用[5]，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。另外对牛和猪的胰蛋白酶有抑制作用但对胰凝乳蛋白酶没有抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显抑制作用。粘蛋白可以抑制昆虫的生长发育，最近这些年在抗虫基因工程中得到了广泛的应用[6]。卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热度和高浓度的脲都是相当稳定的，在有机溶剂都有较高耐受性（在50%丙酮或10%?三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度），而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。鸡卵类粘蛋白的等电点有一定的范围，大致在pH4.04.5，所以可以采用有机溶剂沉淀法分级沉淀粘蛋白的粗品。?
禽蛋中蛋白质含量不但丰富，而且种类繁多已证实禽蛋中含有数百种蛋白质，现在鉴定出的蛋白质种类已经有40余种粘蛋白也是其中之一，卵类粘蛋白的分离方法的研究最早由Lineweaver和Murray[7] 报道，他们使用TCA丙酮法分离得到卵类粘蛋白，其回收率为45%50%，纯度为80%，此法被后人作为卵类黏蛋白的粗分离方法而广泛应用[8]。凝胶过滤色谱也常用于粘蛋白的分离，鉴于粘蛋白的超高分子量，其在合适的凝胶过滤介质中会先于其他粘蛋白被洗脱下来。Young和Gardenr（1970）[9]首次用凝胶渗透色谱对粘蛋白进行了纯化，获得了可溶性的粘蛋白样品。此方法较等电点沉降法相比可以获得高的纯度。Fabf ola Cristina de Oliveira等[10]在2009年研究了通过双水相技术分离纯化粘蛋白。蛋白质含量测定是生物制品质量控制的重要指标之一[11]。蛋白质的含量测定的方法有考马斯亮蓝G25法，原理[12]是依据蛋白质染料结合的原理，可定量的测定微量蛋白质的浓度，该方法快速，灵敏，能满足蛋白质定量分析的要求。
1.2 卵类粘蛋白的理化性质
卵类粘蛋白含量约为总蛋清蛋白质的11 % 分子量为28kDa[13]，等电点为4.1，每个分子包含186个氨基酸，约含2025%左右的碳水化合物[14]。每个分子由三个结构相互独立的同源结构域串联而成，并通过分子间二硫键相互连接，表现为一个球蛋白分子 卵类粘蛋白在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度脉、有机溶剂，均有较高的耐受性[15]。但在强酸、碱的条件下，易引起变性。卵类粘蛋白带有四种糖基，因此有较强的吸水性。在50%的丙酮或5%的三氯乙酸盐水溶液中，仍有较好的溶解度。所以，选择合适的pH，丙酮浓度和三氯乙酸盐浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵类粘蛋白。研究表明，粘蛋白经三氯乙酸一丙酮或是8 mol机尿素处理都不会变性。
1.3 提取分离纯化方法
目前提取制备粘蛋白的方法主要有密度梯度离心法、等电点沉降法和凝胶过滤色谱法等。其中文献报道应用最多的方法是等电点沉降法((Omana et al 2010)，然而在此制备过程中，粘蛋白与蛋清中其它蛋白质易结合形成共沉淀，因此该方法得到的粘蛋白样品纯度通常比较低，一般小于65% (Omana and Wu 2009a )。根据离子的种类和强度影响蛋白质一蛋白质相互作用的原理，可以通过在蛋白质沉降的过程中添加一定离子强度的盐来提高粘蛋白的纯度。最近虽然己经有研究者通过该方法进行了相关的尝试，并且获得了较好的结果(Omana and
1 前言
1.1 粘蛋白的研究现状 1
1.2 卵类粘蛋白的理化性质 2
1.3 提取分离纯化方法 2
1.4 论文研究的意义 3
2 粘蛋白含量测定的方法学建立
2.1 仪器与试剂 4
2.1.1 仪器 4
2.1.2 试剂 4
2.2.1 与实验相关溶液的配制 5
2.2.2 标准曲线的绘制 5
2.2.3 稳定性试验 6
2.2.4 精密度试验 6
2.2.5 回收率试验 6
2.3 小结 7
3 粘蛋白的制备及活性测定
3.1 材料与仪器 8
3.2 溶液配制及填料处理 8
3.3 技术路线 9
3.4 鸡蛋中粘蛋白的提取 9
3.5 粘蛋白的分离 10
3.5.1 冷丙酮沉淀粘蛋白粗品 10
3.5.2 去除残留丙酮试剂 10
3.6 粘蛋白的纯化 10
3.6.1 Sephadex G25层析柱脱盐 10
3.6.2 DAEE纤维素离子交换法除杂质蛋白 10
3.6.3 透析除盐 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
的提取 9
3.5 粘蛋白的分离 10
3.5.1 冷丙酮沉淀粘蛋白粗品 10
3.5.2 去除残留丙酮试剂 10
3.6 粘蛋白的纯化 10
3.6.1 Sephadex G25层析柱脱盐 10
3.6.2 DAEE纤维素离子交换法除杂质蛋白 10
3.6.3 透析除盐 11
3.7 含量测定 11
3.8 活性检测 12
3.8.1 实验所需试剂 12
3.8.2 检测方法 12
3.8.4 实验结果 13
3.9 小结 14
全文总结 16
参考文献 17
致 谢 19
1 前言
粘蛋白是生物体防御体系内很重要的组成部分，或者说是不可或缺的一部分，因为它是生物抵抗外界防御的基础[1]。然而几乎所有粘蛋白目前己知的功能均是在哺乳动物中发现的，对禽蛋中粘蛋白的研究相对较少。粘蛋白是一类髙分子量的硫酸酯糖蛋白，主要存在于蛋清浓厚蛋白中，这种蛋白质呈纤维状，在溶液中具有较高的粘性，有维持蛋清浓厚蛋白组成及抑制滤过性病毒的血球凝集反应等作用，同时对维持蛋清的凝胶特性以及起泡稳定性也具有重要的作用。最近的研究表明粘蛋白还具有抗菌[2]、抗病毒、抑制肿瘤细胞的增殖以及降低血清胆固醇等多种生物活性，不仅具有生物学意义，而且具有重要的医学、营养学和保健方面的研究价值[3]。同蛋清中的其它主要蛋白质如卵白蛋白、溶菌酶等相比，目前关于粘蛋白的研究很少。本论文就粘蛋白的提取、分离、纯化和活性测定做初步研究。
鸡卵类粘蛋白具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用[4]，胰蛋白酶能水解酯键，酰胺键和肽键，利用这一性质用人工合成的底物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的活力，由此可计算卵类粘蛋白的活力。
1.1 粘蛋白的研究现状
鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，根据研究它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用[5]，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。另外对牛和猪的胰蛋白酶有抑制作用但对胰凝乳蛋白酶没有抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显抑制作用。粘蛋白可以抑制昆虫的生长发育，最近这些年在抗虫基因工程中得到了广泛的应用[6]。卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热度和高浓度的脲都是相当稳定的，在有机溶剂都有较高耐受性（在50%丙酮或10%?三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度），而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。鸡卵类粘蛋白的等电点有一定的范围，大致在pH4.04.5，所以可以采用有机溶剂沉淀法分级沉淀粘蛋白的粗品。?
禽蛋中蛋白质含量不但丰富，而且种类繁多已证实禽蛋中含有数百种蛋白质，现在鉴定出的蛋白质种类已经有40余种粘蛋白也是其中之一，卵类粘蛋白的分离方法的研究最早由Lineweaver和Murray[7] 报道，他们使用TCA丙酮法分离得到卵类粘蛋白，其回收率为45%50%，纯度为80%，此法被后人作为卵类黏蛋白的粗分离方法而广泛应用[8]。凝胶过滤色谱也常用于粘蛋白的分离，鉴于粘蛋白的超高分子量，其在合适的凝胶过滤介质中会先于其他粘蛋白被洗脱下来。Young和Gardenr（1970）[9]首次用凝胶渗透色谱对粘蛋白进行了纯化，获得了可溶性的粘蛋白样品。此方法较等电点沉降法相比可以获得高的纯度。Fabf ola Cristina de Oliveira等[10]在2009年研究了通过双水相技术分离纯化粘蛋白。蛋白质含量测定是生物制品质量控制的重要指标之一[11]。蛋白质的含量测定的方法有考马斯亮蓝G25法，原理[12]是依据蛋白质染料结合的原理，可定量的测定微量蛋白质的浓度，该方法快速，灵敏，能满足蛋白质定量分析的要求。
1.2 卵类粘蛋白的理化性质
卵类粘蛋白含量约为总蛋清蛋白质的11 % 分子量为28kDa[13]，等电点为4.1，每个分子包含186个氨基酸，约含2025%左右的碳水化合物[14]。每个分子由三个结构相互独立的同源结构域串联而成，并通过分子间二硫键相互连接，表现为一个球蛋白分子 卵类粘蛋白在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度脉、有机溶剂，均有较高的耐受性[15]。但在强酸、碱的条件下，易引起变性。卵类粘蛋白带有四种糖基，因此有较强的吸水性。在50%的丙酮或5%的三氯乙酸盐水溶液中，仍有较好的溶解度。所以，选择合适的pH，丙酮浓度和三氯乙酸盐浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵类粘蛋白。研究表明，粘蛋白经三氯乙酸一丙酮或是8 mol机尿素处理都不会变性。
1.3 提取分离纯化方法
目前提取制备粘蛋白的方法主要有密度梯度离心法、等电点沉降法和凝胶过滤色谱法等。其中文献报道应用最多的方法是等电点沉降法((Omana et al 2010)，然而在此制备过程中，粘蛋白与蛋清中其它蛋白质易结合形成共沉淀，因此该方法得到的粘蛋白样品纯度通常比较低，一般小于65% (Omana and Wu 2009a )。根据离子的种类和强度影响蛋白质一蛋白质相互作用的原理，可以通过在蛋白质沉降的过程中添加一定离子强度的盐来提高粘蛋白的纯度。最近虽然己经有研究者通过该方法进行了相关的尝试，并且获得了较好的结果(Omana and
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/zygc/1245.html
