银杏叶内生真菌分离及鉴定(附件)
摘 要本实验利用组织分离法对药用植物银杏叶内生真菌进行分离，采用菌丝顶端纯化法逐对其内生真菌进行纯化。结果从银杏叶中分离得到14株内生真菌，经初步鉴定为6个属。结果表明，银杏叶中含有丰富的内生真菌，为以后利用银杏内生真菌资源奠定了基础。 目 录
1 前言
1.1 内生真菌研究现状 .1
1.1.1 内生真菌的定义......1
1.1.2 内生真菌生物学作用.1
1.1.3 我国内生真菌的研究概况...2
1.2 银杏的研究概况.3
1.2.1 银杏简介......3
1.2.2 银杏活性研究.4
1.2.3 银杏叶化学成分研究.4
1.3 研究的目的及意义4
2 实验内容
2.1 材料与方法.. 5
2.1.1 植物样品5
2.1.2 主要试剂.....5
2.1.3 培养基..5
2.1.4 仪器与设备..5
2.1.5 实验方法6
2.2 结果与分析...8
2.2.1 表面消毒效果的检查... 8
2.2.2 银杏内生真菌的分离鉴定结果....8
3 讨论
3.1 内生真菌分离过程中植物材料表面消毒技术...10
3.2 内生真菌分离纯化技术..10
参考文献 11
致谢... 13
1 前言
1.1 内生真菌研究现状
1.1.1 内生真菌的定义
内生真菌（endophytic fungi）泛指在某一阶段生活在健康植物体内，但对寄主植物组织与器官并不引起明显侵染的真菌[1]。内生真菌能够产生与宿主植物相同或者类似的次生代谢产物，也可产生新化合物。经研究表明，从植物内生真菌中分离的生物活性物质有51%是新化合物[2]。 健康植物的根，茎，叶，果实中富含数量多样的内生真菌，这些内生真菌可运用微生物学方法，如组织分离法将其从植物组织中分离，为保证分离得到的菌为植物的内生真菌而非外部的真菌，需要对植物组织进行严格的表面消毒。研究植物
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
植物组织与器官并不引起明显侵染的真菌[1]。内生真菌能够产生与宿主植物相同或者类似的次生代谢产物，也可产生新化合物。经研究表明，从植物内生真菌中分离的生物活性物质有51%是新化合物[2]。 健康植物的根，茎，叶，果实中富含数量多样的内生真菌，这些内生真菌可运用微生物学方法，如组织分离法将其从植物组织中分离，为保证分离得到的菌为植物的内生真菌而非外部的真菌，需要对植物组织进行严格的表面消毒。研究植物内生真菌主要包括在药用植物，羊茅属植物，热带树木等三方面。
1.1.2 内生真菌生物学作用
由于内生真菌能够产生多种活性物质和自身的代谢产物对植物施加影响，使其具有重要的生物学活性。
（1）对宿主植物生长有促进作用
对被感染内生真菌和未感染内生真菌的同种植株进行观察发现，前者比后者生长速度快，表现在植物生长发育的多个方面，内生真菌都能不同程度的起到一定的促进植物生长发育作用。究其原因，是因为许多内生真菌寄生于植物体内，可以合成一些化学物质，如IAA，生长素，赤霉素以及细胞激动素等，而这些正是植物生长所需的调节物质，能直接促进宿主植物吸收S，P等营养元素。
（2）对宿主的抗逆性有增强作用
对被感染内生真菌和未感染内生真菌的同种植株进行观察发现，前者比后者在抗逆性方面表现明显的优势，前者可增强宿主的抗逆性，具体表现为：第一，植物耐高温，抗干旱以及抗酸碱能力显著提高等；第二，对抵抗病虫害，阻抑昆虫和食草动物的采食方面也表现明显优势。产生这样的结果，主要是因为寄生在植物体内的内生真菌产生了多样的次生代谢产物，如黑麦草碱，麦角碱，波胺和覃青毒素等，这些次生代谢物对食草动物和昆虫具有毒性，因而能提高植物对多种食草昆虫的抗性[36]。
（3）对植物的他感作用增强
研究发现，被内生真菌感染了的牧草，其生存能力大为增强，导致的结果是这样的牧草连年蔓延，其他的植物就失去了生存的空间，最终死亡。主要是因为内生真菌能够产生毒麦碱，对邻近未感染内生真菌产生他感作用，使其不能生长。
（4）其他作用
某些真菌侵入宿主细胞后，在特定的环境和生理条件下刺激宿主产生在正常情况不能产生的小分子物质，促进宿主体内次生代谢物的形成和积累，也能将植物体内源和外源的化学物质转化为另类物质。如江东福等以柬埔寨龙血树（Dracaena cochinchinesis）为材料分离到33株内生真菌，通过活体接种检测其对血褐产生的影响。结果表明， 以禾谷镰刀菌龙血树变种（Fusarium graminearurn vacdracaena）为主的4株镰刀菌可使血褐形成量提高66%—120%。Redlin和Carris的研究也表明，植物内生真菌在植物的正常生活及生活力方面起重要的作用，它们能影响植物的生态和生理过程[7,8]。
1.1.3 我国内生真菌的研究概况
我国对内生真菌的研究虽起步较晚，但也取得了一些成绩。通过对多种植物内生真菌进行分离纯化，已获得种类丰富的菌种，并对优势菌种进行大量发酵，从发酵液中提取并获得了多种纯品化合物，如生物碱类，黄酮类，萜类，苷类等，有的表现良好的抗肿瘤，抗菌，抗糖尿病，抗氧化以及促进植物生长等作用，从而得到了具有良好生物学活性的化合物[9]。银杏内生真菌的研究主要是由国内一些学者们开展，2003年王梅霞首次从银杏中筛选分离出产生黄铜类化合物的内生真菌，2007年黄蓉从银杏枝条和叶片中分离到77个真菌菌株[10]。在这方面取得了一定的成绩。同时，在对植物内生真菌深入的研究过程中，存在以下问题：
第一，此研究集中在有益菌株的分离筛选和活性物质的提取上，对植物内生真菌多样性缺乏调查。第二，现在还没有能够进行商业化生产和进入应用阶段的有益菌株，急需对内生真菌进行全面深入的研究或遗传改造，使其早日为人类带来社会、生态、经济效益。第三，内生真菌能促进或刺激某些药物的形成，这是内生真菌与宿主植物之间的共生，但其具体机制尚不明确，需要进一步的研究[11]。同时，也发现了亟待解决的其他问题：第一，通过组织分离法，并不能保证能将所有寄生于植物中的内生真菌都分离出来，即使使用不同的培养基，也是如此，可能存在一些内生真菌只在寄主体内能存活，而不能在外部的培养基中生存。第二，有些内生真菌在人工培养基中不会产生孢子，无法用传统的形态学鉴定方法进行鉴定，而采用分子学方法鉴定成本又太大，这给鉴定上带来了困难。
我国药用植物资
1 前言
1.1 内生真菌研究现状 .1
1.1.1 内生真菌的定义......1
1.1.2 内生真菌生物学作用.1
1.1.3 我国内生真菌的研究概况...2
1.2 银杏的研究概况.3
1.2.1 银杏简介......3
1.2.2 银杏活性研究.4
1.2.3 银杏叶化学成分研究.4
1.3 研究的目的及意义4
2 实验内容
2.1 材料与方法.. 5
2.1.1 植物样品5
2.1.2 主要试剂.....5
2.1.3 培养基..5
2.1.4 仪器与设备..5
2.1.5 实验方法6
2.2 结果与分析...8
2.2.1 表面消毒效果的检查... 8
2.2.2 银杏内生真菌的分离鉴定结果....8
3 讨论
3.1 内生真菌分离过程中植物材料表面消毒技术...10
3.2 内生真菌分离纯化技术..10
参考文献 11
致谢... 13
1 前言
1.1 内生真菌研究现状
1.1.1 内生真菌的定义
内生真菌（endophytic fungi）泛指在某一阶段生活在健康植物体内，但对寄主植物组织与器官并不引起明显侵染的真菌[1]。内生真菌能够产生与宿主植物相同或者类似的次生代谢产物，也可产生新化合物。经研究表明，从植物内生真菌中分离的生物活性物质有51%是新化合物[2]。 健康植物的根，茎，叶，果实中富含数量多样的内生真菌，这些内生真菌可运用微生物学方法，如组织分离法将其从植物组织中分离，为保证分离得到的菌为植物的内生真菌而非外部的真菌，需要对植物组织进行严格的表面消毒。研究植物
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
植物组织与器官并不引起明显侵染的真菌[1]。内生真菌能够产生与宿主植物相同或者类似的次生代谢产物，也可产生新化合物。经研究表明，从植物内生真菌中分离的生物活性物质有51%是新化合物[2]。 健康植物的根，茎，叶，果实中富含数量多样的内生真菌，这些内生真菌可运用微生物学方法，如组织分离法将其从植物组织中分离，为保证分离得到的菌为植物的内生真菌而非外部的真菌，需要对植物组织进行严格的表面消毒。研究植物内生真菌主要包括在药用植物，羊茅属植物，热带树木等三方面。
1.1.2 内生真菌生物学作用
由于内生真菌能够产生多种活性物质和自身的代谢产物对植物施加影响，使其具有重要的生物学活性。
（1）对宿主植物生长有促进作用
对被感染内生真菌和未感染内生真菌的同种植株进行观察发现，前者比后者生长速度快，表现在植物生长发育的多个方面，内生真菌都能不同程度的起到一定的促进植物生长发育作用。究其原因，是因为许多内生真菌寄生于植物体内，可以合成一些化学物质，如IAA，生长素，赤霉素以及细胞激动素等，而这些正是植物生长所需的调节物质，能直接促进宿主植物吸收S，P等营养元素。
（2）对宿主的抗逆性有增强作用
对被感染内生真菌和未感染内生真菌的同种植株进行观察发现，前者比后者在抗逆性方面表现明显的优势，前者可增强宿主的抗逆性，具体表现为：第一，植物耐高温，抗干旱以及抗酸碱能力显著提高等；第二，对抵抗病虫害，阻抑昆虫和食草动物的采食方面也表现明显优势。产生这样的结果，主要是因为寄生在植物体内的内生真菌产生了多样的次生代谢产物，如黑麦草碱，麦角碱，波胺和覃青毒素等，这些次生代谢物对食草动物和昆虫具有毒性，因而能提高植物对多种食草昆虫的抗性[36]。
（3）对植物的他感作用增强
研究发现，被内生真菌感染了的牧草，其生存能力大为增强，导致的结果是这样的牧草连年蔓延，其他的植物就失去了生存的空间，最终死亡。主要是因为内生真菌能够产生毒麦碱，对邻近未感染内生真菌产生他感作用，使其不能生长。
（4）其他作用
某些真菌侵入宿主细胞后，在特定的环境和生理条件下刺激宿主产生在正常情况不能产生的小分子物质，促进宿主体内次生代谢物的形成和积累，也能将植物体内源和外源的化学物质转化为另类物质。如江东福等以柬埔寨龙血树（Dracaena cochinchinesis）为材料分离到33株内生真菌，通过活体接种检测其对血褐产生的影响。结果表明， 以禾谷镰刀菌龙血树变种（Fusarium graminearurn vacdracaena）为主的4株镰刀菌可使血褐形成量提高66%—120%。Redlin和Carris的研究也表明，植物内生真菌在植物的正常生活及生活力方面起重要的作用，它们能影响植物的生态和生理过程[7,8]。
1.1.3 我国内生真菌的研究概况
我国对内生真菌的研究虽起步较晚，但也取得了一些成绩。通过对多种植物内生真菌进行分离纯化，已获得种类丰富的菌种，并对优势菌种进行大量发酵，从发酵液中提取并获得了多种纯品化合物，如生物碱类，黄酮类，萜类，苷类等，有的表现良好的抗肿瘤，抗菌，抗糖尿病，抗氧化以及促进植物生长等作用，从而得到了具有良好生物学活性的化合物[9]。银杏内生真菌的研究主要是由国内一些学者们开展，2003年王梅霞首次从银杏中筛选分离出产生黄铜类化合物的内生真菌，2007年黄蓉从银杏枝条和叶片中分离到77个真菌菌株[10]。在这方面取得了一定的成绩。同时，在对植物内生真菌深入的研究过程中，存在以下问题：
第一，此研究集中在有益菌株的分离筛选和活性物质的提取上，对植物内生真菌多样性缺乏调查。第二，现在还没有能够进行商业化生产和进入应用阶段的有益菌株，急需对内生真菌进行全面深入的研究或遗传改造，使其早日为人类带来社会、生态、经济效益。第三，内生真菌能促进或刺激某些药物的形成，这是内生真菌与宿主植物之间的共生，但其具体机制尚不明确，需要进一步的研究[11]。同时，也发现了亟待解决的其他问题：第一，通过组织分离法，并不能保证能将所有寄生于植物中的内生真菌都分离出来，即使使用不同的培养基，也是如此，可能存在一些内生真菌只在寄主体内能存活，而不能在外部的培养基中生存。第二，有些内生真菌在人工培养基中不会产生孢子，无法用传统的形态学鉴定方法进行鉴定，而采用分子学方法鉴定成本又太大，这给鉴定上带来了困难。
我国药用植物资
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