杭白菊中木犀草素的含量测定
摘 要本文对杭白菊中的木犀草素进行含量测定，并建立杭白菊中木犀草素的HPLC检测方法。采用的色谱条件为：色谱柱为Diamonsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸（28: 72），流速1mL·min-1，进样量为10 μL，柱温为25℃，检测波长340 nm。实验结果表明，木犀草素在0.07312-0.5484 μg范围内线性良好；精密度试验RSD为0.5%，表明精密度良好；重复性试验RSD为0.29%，平均含量为0.43 mg·g-1，表明重复性良好；稳定性试验RSD为0.45%，表明稳定性良好；平均加样回收率为99.9%，RSD为0.88%。本实验所建立的方法操作简单、结果准确、可靠、重现性好，可用于杭白菊的质量控制。关健词：杭白菊；木犀草素；含量测定；高效液相色谱AbstractIn this study, HPLC coupled with diode array detection was successfully developed to determine Lutelin of Chrysanthemum morifolium. The chromatographic conditions for chromatographic column for DiamonsiL C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 m) as the mobile phase acetonitrile and 0.1% formic acid (28: 72), The flow rate was 1.0 mL min-1, the sample injection volume was 10 μL and the column and sample temperature were at 25 ?C. The DAD was set at 340 nm for real-time monitoring of the peak intensity. Experimental results show that luteolin was in 0.07312-0.5484 μg with good range linear ; it showed good precision with RSD 0.5%;
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DAD was set at 340 nm for real-time monitoring of the peak intensity. Experimental results show that luteolin was in 0.07312-0.5484 μg with good range linear ; it showed good precision with RSD 0.5%; In repeatability test, average content is 0.43mg·g-1 ( RSD = 0.29%), which indicated good repeatability; It also showed good stability with RSD=0.45%; In recovery test, the average recovery rate was 99.9%, and the RSD was 0.88%. The method established in this paper is simple, reliable and reproducible, and wich could be used for the quality control of Chrysanthemum morifolium. Keywords: Chrysanthemum morifolium; Lutelin; determination; HPLC1 概述1.1 选题背景 11.2 杭白菊的国内外发展概况 11.3 杭白菊的资源分布 21.4 杭白菊的产地加工方法 21.5 杭白菊的主要化学成分 21.5.1 挥发油类 21.5.2 黄酮类化合物 21.5.3 有机酸类 31.5.4 其它 31.6 杭白菊的主要药理活性 31.6.1 抗菌、抗炎作用 31.6.2 抗氧化作用 41.6.3 心血管保护作用 41.7 杭白菊的临床主治 51.7.1 偏头痛 51.7.2 眩晕 51.7.3 眼疾 51.7.4 急慢性咽炎 51.7.5 溃疡性结肠炎 51.8 木犀草素的概述 51.8.1 木犀草素的理化性质 61.8.2 木犀草素的来源 61.8.3 木犀草素的提取工艺 61.8.4 木犀草素的药理活性 61.9 高效液相色谱法的概述 82 实验研究2.1 仪器和试剂 92.1.1 仪器 92.1.2 试剂 92.2 实验方法 92.2.1 色谱条件 92.2.2 对照品溶液制备 102.2.3 供试品溶液的制备 102.2.4 线性关系考察 102.2.5 精密度试验 112.2.7 稳定性试验 112.2.8 加样回收率试验 122.2.9 样品的测定 122.3 讨论 12结论 14参考文献 15致谢 191 概 述1.1 选题背景 杭白菊为草本菊科植物，花瓣洁白如玉，花蕊黄如纯金，杭白菊又被称为甘菊[1]，亦名“小汤黄”、“小白菊”，是我国传统的药用栽培植物，浙江省著名的八大名药材“浙八味”之一，也是菊花茶中较好的一个品种，又有“千叶玉玲珑”之称[2]。杭白菊性微寒、味甘苦[3]。经现代医学药理研究表明：杭白菊不仅具有止痢、消炎、明目、降压、降脂、强身的作用[1]，而且可用于治疗湿热黄疸、胃部胀痛、水肿尿少、高血压、偏头痛、急性结膜炎等症[4]。以杭白菊的菊汤沐浴，具有去痒爽身、护肤美容的功能[3]。 杭白菊的品种有湖菊、小洋菊、大洋菊、小白菊、小湖菊[4]。杭白菊主产于浙江的桐乡，其具有非常悠久的文化渊远和种植历史，种植面积非常大、产量高、品质较好。据清代的《本草从新》中记载：“甘菊花，家园杭产者良，有黄、白两种，单瓣味甘者入药、点茶、酿酒、作枕均俱佳”[5]。江浙地区中又有“黄菊宜入药，白菊宜入茶”的说法[5]，可见杭白菊除了药用，在茶用方面也是非常广泛[6]。1.2 杭白菊的国内外发展概况 杭白菊的发展从古到今已有3000多年的历史，最早的文字记载见于《尔雅》，《离骚》中也有“朝饮木兰之坠露兮，夕餐秋菊之落英”的佳句[6]。东晋有陶渊明“采菊东篱下，悠然见南山”及“秋菊有佳色，浥露掇其英”[7]的赏菊诗句。 杭白菊在我国具有悠久的栽培历史，其与安徽地区的滁菊、毫菊，河南地区的怀菊，河北地区的祁菊，山东地区的济菊，都是国内享有名誉的茶用菊[8]。杭白菊具有较高茶用价值，同时其具有延年益寿的神奇功效，《补农书》载：“甘菊性甘温，久服最有益”。元代《本草衍义补遗》中记载：菊“花能补阴”。李时珍《本草纲目》中道：“菊能朱孺之皆以服菊成仙”[9]。可见杭白菊的功效之神奇。元代时，曾用杭白菊代茶饮用，其色香味不亚于龙井茶，经常饮用，可增强毛细血管的抵抗力，抑制毛细血管的通性，具有抗炎强身的疗效[10]。 随着杭白菊产业的不断发展，目前杭白菊在我国的覆盖率达总菊花面积的38.36%，已经发展成为我国药用及茶用一体的特色产业，深受人们的欢迎[11]。1.3 杭白菊的资源分布 杭白菊的资源分布较为广泛。主要集中产于浙江桐乡、海宁、嘉兴，山东，河南等地[11]。长期以来，由于桐乡地处江南水乡平原，自然条件优越，再加上长期积累的丰富经验，1949年种植面积达14500余亩，年产384吨；1979年后，杭白菊种植不断发展，据1998年统计，全市达30000多亩，总产量达500多吨，其种植面积居全国之首位，为此，1999年桐乡被命名为“中国杭白菊之乡”。2015年桐乡的杭白菊总产量占总菊花产量的90%，目前种植地主要分布在桐乡的同福、石门、龙翔、凤鸣、梧桐等。杭白菊的种植覆盖面积越来越大，前景也越来越广，已从单纯的中药材逐渐发展到饮品，保健品等各个行业[12]。1.4 杭白菊的产地加工方法杭白菊的产地加工主要有蒸法、杀青干燥法、直接干燥法等方法。干燥方法可选用烘干法、晒干法等方法。蒸法是将杭白菊蒸5分钟，取出，置通风处晾干；蒸汽杀青法是用杀青机杀青1-2分钟，取出，置于通风处晾干；烘干法是用鼓风干燥机60℃直接烘干；晒干法是直接将杭白菊放到太阳下翻晒至干[12]。1.5 杭白菊的主要化学成分杭白菊主要含有挥发油类、黄酮类、有机酸类等化合物[13]。据统计杭白菊中黄酮类化合物有47个，主要分为三种结构类型，即黄酮类、二氢黄酮类和黄酮醇类；酚酸类中有19个化合物；包括绿原酸、咖啡酰基奎宁酸和咖啡酰基阿魏酸类等；三萜类有30个化合物，主要分为蒲公英甾醇型、齐敦果酸型、乌苏烷型[14]。1.5.1 挥发油类 杭白菊中的挥发油具有特殊浓郁的气味，主要含单萜和倍半萜及其含氧衍生物，如，樟脑、龙脑、乙酸龙脑、桉叶油素、对聚花伞素、姜黄烯、石竹烯、金合欢烯、氧化石竹烯、α-杜松醇、杜松脑、冰片脂、芳樟醇、α-侧柏酮烯、β-菲兰烯、χ-菲兰烯、γ松油烯、叔丁基苯、χ萜品烯、浦勒烯、优葛缕酮、β-榄香烯、假紫罗酮、γ-松油醇、石竹烯、香木兰稀等[13-15]。1.5.2 黄酮类化合物黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物。它们的分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具有碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，因此又称为黄碱素[16]。(图1.1)。图1.1 黄酮类化合物的基本结构杭白菊中富含黄酮类化合物，主要含有黄酮及其苷[17]、黄酮醇及其苷，如，香草木素、木犀草素、芹菜素香、叶木素7-O-β-D葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D葡萄糖苷、刺槐苷、金合欢素、山奈酚、异泽兰黄素 等[18-20]。1.5.3 有机酸类杭白菊中广泛存在有机酸类成分[21]，主要有：绿原酸甲酯、绿原酸乙酯、隐绿原酸（4-咖啡酰基奎尼酸）、新绿原酸（5-咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸A（3,5-二咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸B（3,4-二咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸C（4,5-二咖啡酰基奎尼酸）、1-异丁酰异绿原酸C、异绿原酸C甲酯、异绿原酸A甲酯、3,4,5-三咖啡酰奎尼酸、莱蓟素（1,3-二咖啡酰基奎尼酸）、3-香豆酰奎尼，还有棕榈酸、亚油酸、硬脂酸、鞣花酸以及饱和脂肪酸等[22-24]。1.5.4 其它杭白菊中还含有多糖和微量元素的成分，如，正戊基呋喃果糖、纯多糖等多糖成分；Fe、Zn、Me、Se、Cu等微量成分。除此之外还含有氨基酸类、及鞣质类化合物[25]。1.6 杭白菊的主要药理活性1.6.1 抗菌、抗炎作用 李英霞等[26]发现杭白菊制剂对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、绿脓杆菌、霍乱孤菌及人型结核杆菌等均有不同程度的抑制作用。殷红[27]等采用体外抗菌法、小鼠耳壳二甲苯肿胀法、角叉菜胶致大鼠足趾肿胀法，观察不同浓度和剂量的杭白菊挥发油对细菌和炎症的影响，并检测PGEZ的含量。结果发现杭白菊挥发油对多种常见感染菌都具有明显的抗菌活性。1.6.2 抗氧化作用秦卫东[28]用不同有机溶剂提取杭白菊中的抗氧化物质，通过实验发现，黄酮类和酚类是杭白菊的主要抗氧化成分。朱妙等[29]以杭白菊、柏皮、豆渣的超声提取物为研究对象，通过油脂氧化实验和清除自由基作用体系，分析比较了三者抗氧化活性，结果发现，柏皮、豆渣和杭白菊的乙醇提取液中都含有一定的抗氧化成分。苏祝成[30]等通过杭白菊浸液对光照核黄素的作用实验，结果发现在实验中产生的超氧化物阴离子自由基有明显的清除作用，杭白菊清除自由基的能力与其多酚类及黄酮类物质的含量有关。于善凯[31]等在对4种桐乡产杭白菊(大洋菊、软梗小洋菊、早小洋菊、异种大白菊)清除自由基的能力进行研究时发现，菊花中含有的萜类和多糖等组分，具有抗自由基和抗氧化活性的作用。方雪玲[32]等对小牛血管平滑肌细胞的凋亡及其抗氧化性进行了研究，结果显示杭白菊醇提液具有抑制小牛VSMC(血管平滑肌细胞)凋亡及促使VSMC培养液SOD值升高、MDA值下降的作用。范广勤[33]等通过铅对小鼠组织脂质过氧化作用及杭白菊对其保护作用的研究，发现杭白菊有一定驱铅作用，这可能与杭白菊中含有的维生素有关。 1.6.3 心血管保护作用 蒋惠娣等[34]对杭白菊的心血管药理作用进行了研究。研究结果表明，杭白菊水提醇沉浸膏制成的制剂可以增加离体家兔、在体狗心脏的冠脉流量。徐万红[35]等应用离体灌流大鼠心脏和无血管影响条件下的离体大鼠单个心室肌细胞模型进行研究，以及沈伟桥[36]等通过杭白菊的心血管药理作用及其作用机制研究进展，均发现杭白菊具有正性肌力作用。缪利英等[37]研究发现杭白菊能明显增加正常蟾蜍心脏以及戊巴比妥钠和低钙所致心衰模型的收缩力，具有强心抗心衰作用。蒋惠娣[38]等在动物体内研究还发现杭白菊乙酸乙脂提取物具有显著的舒血管作用。1.7 杭白菊的临床主治1.7.1 偏头痛 刘炳凤[39]应用杭菊泡茶治疗偏头痛，32例病人中，康复的有23人。服用期最短半月，最长的为两个月。锡安[40]同样采用杭菊汤治疗偏头痛中，以七剂为一疗程，患者在用药两个疗程后症状都明显减轻，在96例患者中，治愈61人，有效40例，有效率达94.79%。1.7.2 眩晕 王永宪[41]以生菊花饮治疗42例。连服六剂是一疗程，结果治愈9例，有效23例。江琳[42]用菊花钩藤饮联合西药治疗眩晕，结果治愈率达93.47%，总有效率达99.8%，疗效非常可观。1.7.3 眼疾周凤建等[43]用杭菊明目饮治疗眼角膜炎，共治疗47例，结果有效率达96.03%。王衍海[44]采用菊花承气汤医治天行赤眼，用药时采用菊花汤冲服芒硝、青黛，每天早晚各一次，同时采用菊花、霜桑叶等适量煎洗双目，每日两次，早晚各一次，结果疗效显著。1.7.4 急慢性咽炎 侯润田[45]采用菊花治疗慢性咽炎300例，结果治愈率达85.46%。1.7.5 溃疡性结肠炎 林静[46]采用菊花熬汤治疗结肠炎病，治疗62例，平均治愈率达72.56%，而且菊花汤剂无副作用，复发率小。1.8 木犀草素的概述木犀草素为黄酮类化合物，多以糖苷的形式存在于多种天然植物中，如：全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、等植物中均含量丰富。其具有消炎抗菌、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒等药理活性。临床应用于止咳、祛痰、消炎、肝炎、以及治疗心血管类疾病[46]。1.8.1 木犀草素的理化性质化学名：3,4,7-四羟黄酮；别名：黄色黄素、黄示灵；化学式：C15H10O6；物理性质：黄色针状结晶，熔点(328-330℃)，微溶于水，具弱酸性，可溶于碱性溶液[45]。1.8.2 木犀草素的来源木犀草素在自然界中分布广泛，最初是从木犀草科木犀草属的草本植物木犀草的叶、茎、枝中分离得到的，目前主要存在于金银花、菊花、白毛夏枯草、洋蓟、紫苏属、黄苓属、落花紫珠、筋骨草、百里香草等天然药材中[45]。1.8.3 木犀草素的提取工艺1.8.3.1 药材预处理将含有木犀草素的药材，经过洗涤，干燥后，粉碎成粗粉备用[47]。1.8.3.2 提取纯化药材粉末加入甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，回流提取，提取液减压浓缩后以石油醚、环己烷等溶剂萃取脱脂，水相过弱极性的大孔吸附树脂，用水洗涤至流出液无色后，以95%乙醇为洗脱剂洗脱，洗脱液减压浓缩、真空干燥并重结晶后得到木犀草素纯品[46-47]。 1.8.4 木犀草素的药理活性1.8.4.1 抗炎 实验研究发现木犀草素的抗炎活性与抑制一氧化氮(NO)和其他炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的产生有关，同时可抑制蛋白质络氨酸的磷酸化以及核转录因子KB(NF-KB)介导的基因表达[46]。1.8.4.2 抗肿瘤 通过研究木犀草素对肿瘤细胞的影响实验[46]，结果发现木犀草素可以选择性抑制前列腺癌和乳腺癌细胞的脂肪酸合成酶活性，抑制肿瘤细胞增长和变异；木犀草素可以显著的降低二甲肼所致的结肠癌的发生率，并且可调节脂质过氧化、抗氧化、抗增殖的作用；木犀草素抑制卵巢癌细胞的侵袭运动能力，与其抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的分泌及下调细胞外信号调节激酶2(ERK2)的表达有关[47]。 1.8.4.3 抗过敏 木犀草素可以抑制免疫球蛋白E介导人的肥大细胞产生的变态反应递质，包括组胺、白三烯、前列腺素D2，以及单核巨噬细胞集落刺激因子的释放，其作用还可以抑制Ca2+内流和蛋白激酶C(PKC)易位的活化[48]。 1.8.4.4 抗氧化 通过木犀草素体外实验，发现木犀草可以保护少突胶质细胞抵抗过氧化氢诱导的氧化损害，强烈抑制巨噬细胞对髓鞘的吞噬作用，显著减少细胞活性氧簇的产生，减少蛋白质活性的表达[49]。1.8.4.5 抗纤维化 木犀草素可以降低肝纤维化，降低肝组织中羟脯氨酸(HYP)、丙二醛(MDA)的含量以及I型前胶原mRNA的表达，还可以抑制肝星状细胞(HSC)的增殖和胶原合成，并可改善博来霉素所致的肺纤维化组织病理学改变，降低肺重量指数、明显降低MDA、升高HYP，抑制肺组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA的表达，抑制人胚肺纤维细胞的增殖，促进其凋亡[50]。 1.8.4.6 抗激素作用 木犀草素具有显著的抗着床活性，口服后能明显增加子宫的重量、直径、子宫内膜的厚度以及其上皮细胞的高度，单独应用时具有类雌激素作用，但和炔雌醇合用时却显示具有抗雌激素作用[51]。 1.8.4.7 对血管的作用 木犀草素可以抑制血管内皮生长因子（VEGF）诱导的兔角膜血管的生成；可以抑制鼠异种移植肿瘤模型的肿瘤生长和血管形成；可以抑制VEGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞的存活和增殖[51]；可以显著抑制血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）诱导的血管平滑肌细胞的增殖和DNA合成；可以阻滞细胞周期的进行；可以降低肾上腺素预收缩血管的张力，拮抗高钾引起的血管收缩，具有动脉舒张作用，其作用机制与直接抑制电压依从性钙通道、受体操纵性钙通道、细胞内钙释放有关[52]。 1.8.4.8 其他 木犀草素可以抑制多种细菌和病毒，如金黄色葡球菌、大肠杆菌、单纯疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒等[53]。其能抑制艾滋病病毒HIV整合酶的活性,具有潜在的抗HIV的作用。木犀草素还可以与严重急性呼吸道综合征（SARS）冠状病毒的S2蛋白结合，从而抑制病毒进入宿主细胞。1.9 高效液相色谱法的概述 高效液相色谱法又称为层析法，从1985年《中国药典》开始使用，其发展迅速，目前已以成为天然药物中有效成分的含量测定和成分分析的重要方法之一。高效液相色谱法因为其性质稳定、可靠、选择性高、灵敏度高的优点，在药用物质的含量测定和组成分析，以及质量控制方面得到了广泛的应用[54]。 色谱法的分离原理：是各组分溶于液相中，经过固定相时，与固定相发生作用大小、强弱不同，就会使其在固定相中滞留时间不相同，因此出柱先后不同，进而形成不同的峰高[55]。 高效液相色谱（HPLC）是在色谱条件的基础上，通过改进填料颗粒度大小和柱压的高低，再在传统液相色谱的基础上引入气相色谱的理论塔板数，同时在技术上引进了高压输液泵，高效的固定相和高灵敏度的检测器使其分析速度快，分离程度高，操作的半自动化强[54]。 高效液相色谱法的特点：①高压强：流动相为液体，流经色谱柱时，受到较大的阻力时，为了迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。②高效率：分离效能高，可选择最佳固定相和流动相以达到最好的分离效果。③高灵敏度：主要表现在紫外检测器的高精密度和准确性。④应用较广泛：百分之七十八以上的有机化合物都可采用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物的分离分析，占据优势。⑤分析速度快、载液流速快：较传统液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等特点，但其也存在着缺点，高效液相色谱的缺点是“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低[55]。2 实验研究2.1 仪器和试剂2.1.1 仪器Waters e2695-2996高效液相色谱系统；Empower工作站（Waters公司）；Diamonsil C18 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；DJ-02型中药粉碎机（上海淀久机械制造公司），KQ5200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。2.1.2 试剂木犀草素（购于中国食品药品鉴定研究院，批号为：111520-201304）；乙腈（Fisher)；娃哈哈纯净水，其它试剂为分析纯。 杭白菊为2015年购于陕西康盛堂药业有限公司，经陕西国际商贸学院雷国莲教授鉴定为菊科植物菊花Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥花蕾。2.2 实验方法2.2.1 色谱条件Diamonsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸（28: 72），流速1 mL·min-1；进样量10 μL；柱温25℃；检测波长340 nm，结果见图2.1，图2.2。图2.1 木犀草素样品HPLC色谱图图2.2 木犀草素对照品HPLC色谱图2.2.2 对照品溶液制备精密称取木犀草苷对照品适量，用甲醇溶解并定容，制成含有对照品0.182mg·mL-1的混标溶液，摇匀，置4℃备用，即得对照品溶液。2.2.3 供试品溶液的制备 称取杭白菊样品（过40目筛）0.5 g，精密加入60%甲醇20 mL，称定，超声处理30 min（功率100，温度25℃），补足减失重量，过0.22 um微孔滤膜，放置4℃备用，作为供试品溶液。2.2.4 线性关系考察分别精密量取木犀草素对照品溶液 2.5、5.0、7.5、10、 15、20 uL，注入到高效液相色谱仪，进行测定。按照2.2.1项下的色谱进条件进行，测定峰面积，以木犀草素对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，y=26162x-15.788，R2=1.0000。结果表明0.07312-0.5484 μg内木犀草素峰面积Y与进样量（μg）X线性关系良好。结果如表2.1和图2.3。表2.1 线性关系考查表进样量22.557.5101520峰面积5232106540301307030196205261705392411523210图2.3 木犀草素标准曲线表2.2.5 精密度试验 精密吸取木犀草素对照品溶液10 uL，注入高效液相色谱仪中，连续进样6次，测定峰面积，结果表明，RSD为0.5%，结果如表2.2所示。表2.2 精密度试验实验编号123456RSD（%）峰面积2617052617152617122616782617122617090.5%2.2.6 重复性试验分别精密称取杭白菊样品适量，平行6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算木犀草素的平均含量为0.43mg·g-1，RSD为0.29%，结果如表2.3所示。表2.3 重复性试验实验编号123456RSD（%）峰面积3176315631693181317231790.29%2.2.7 稳定性试验 按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h内重复进样6次，按照2.2.1项下的色谱条件进行，测定峰面积，结果表明，RSD为 0.45%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。结果如表2.4所示。表2.4 稳定性试验测定时间（h）02481224RSD（%）峰面积3176316831973181 319431600.45%2.2.8 加样回收率试验 精密称取杭白菊样品6份，分别加入木犀草素对照品适量，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下的色谱条件进行，测定峰面积，计算回收率。结果平均回收率为99.9%，RSD为0.88%，结果见表2.5所示。表2.5 回收率实验结果（n=6）序号样品含量/mg对照品加入量/mg实测值回收率/%平均回收率RSD/%10.4880.4550.94099.499.90.8820.4580.4550.90999.230.4620.4550.91499.540.4380.4550.895100.550.4280.4550.889101.460.4460.4550.89899.32.2.9 样品的测定 取3批杭白菊样品， 按供试品溶液制备方法及含量测定方法测定其含量，结果见表2.6。表2.6 杭白菊样品含量测定结果（n=3）批号木犀草素含量（ mg·g-1）15010.48815020.40815030.463平均值0.4532.3 讨论（1）在杭白菊木犀草素测定中，本实验采用不同比例含量的甲醇、乙醇进行提取，结果发现60%甲醇的提取率最高；对提取方法进行比较发现，超声提取法的提取率较高，而回流提取法提取率较低，因此本文采用60%甲醇，超声提取30min对杭白菊中的木犀草素进行含量测定的提取方法。（2）参考文献资料，对杭白菊中的木犀草素的含量测定方法进行比较，发现HPLC法较为简单、快速、准确。同时对色谱条件进行比较筛选。分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸进行比较发现以乙腈-0.1%甲酸为洗脱溶剂，所得色谱图较好，峰的分离度较高；因此，最终确定以乙腈-0.1%甲酸（28: 72）为本实验的流动相。 结 论本文是采用HPLC测定杭白菊中木犀草素的含量，通过实验结果可以得出，木犀草素在0.7312-0.5484 μg范围内线性关系良好；精密度(RSD=0.5%）、重复性（RSD=0.29%）、稳定性（RSD=0.45%）均良好；木犀草素的平均回收率99.9%，RSD=0.88%(n=6)，表明回收率良好；木犀草素样品的含量测定，平均含量为0.453 mg·g-1。 本实验建立的HPLC检测方法快速简便、可靠易行、准确度、精密度、稳定性均良好，可用于杭白菊的质量控制，为评价的杭白菊的质量提供理论依据。参考文献[1] 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DAD was set at 340 nm for real-time monitoring of the peak intensity. Experimental results show that luteolin was in 0.07312-0.5484 μg with good range linear ; it showed good precision with RSD 0.5%; In repeatability test, average content is 0.43mg·g-1 ( RSD = 0.29%), which indicated good repeatability; It also showed good stability with RSD=0.45%; In recovery test, the average recovery rate was 99.9%, and the RSD was 0.88%. The method established in this paper is simple, reliable and reproducible, and wich could be used for the quality control of Chrysanthemum morifolium. Keywords: Chrysanthemum morifolium; Lutelin; determination; HPLC1 概述1.1 选题背景 11.2 杭白菊的国内外发展概况 11.3 杭白菊的资源分布 21.4 杭白菊的产地加工方法 21.5 杭白菊的主要化学成分 21.5.1 挥发油类 21.5.2 黄酮类化合物 21.5.3 有机酸类 31.5.4 其它 31.6 杭白菊的主要药理活性 31.6.1 抗菌、抗炎作用 31.6.2 抗氧化作用 41.6.3 心血管保护作用 41.7 杭白菊的临床主治 51.7.1 偏头痛 51.7.2 眩晕 51.7.3 眼疾 51.7.4 急慢性咽炎 51.7.5 溃疡性结肠炎 51.8 木犀草素的概述 51.8.1 木犀草素的理化性质 61.8.2 木犀草素的来源 61.8.3 木犀草素的提取工艺 61.8.4 木犀草素的药理活性 61.9 高效液相色谱法的概述 82 实验研究2.1 仪器和试剂 92.1.1 仪器 92.1.2 试剂 92.2 实验方法 92.2.1 色谱条件 92.2.2 对照品溶液制备 102.2.3 供试品溶液的制备 102.2.4 线性关系考察 102.2.5 精密度试验 112.2.7 稳定性试验 112.2.8 加样回收率试验 122.2.9 样品的测定 122.3 讨论 12结论 14参考文献 15致谢 191 概 述1.1 选题背景 杭白菊为草本菊科植物，花瓣洁白如玉，花蕊黄如纯金，杭白菊又被称为甘菊[1]，亦名“小汤黄”、“小白菊”，是我国传统的药用栽培植物，浙江省著名的八大名药材“浙八味”之一，也是菊花茶中较好的一个品种，又有“千叶玉玲珑”之称[2]。杭白菊性微寒、味甘苦[3]。经现代医学药理研究表明：杭白菊不仅具有止痢、消炎、明目、降压、降脂、强身的作用[1]，而且可用于治疗湿热黄疸、胃部胀痛、水肿尿少、高血压、偏头痛、急性结膜炎等症[4]。以杭白菊的菊汤沐浴，具有去痒爽身、护肤美容的功能[3]。 杭白菊的品种有湖菊、小洋菊、大洋菊、小白菊、小湖菊[4]。杭白菊主产于浙江的桐乡，其具有非常悠久的文化渊远和种植历史，种植面积非常大、产量高、品质较好。据清代的《本草从新》中记载：“甘菊花，家园杭产者良，有黄、白两种，单瓣味甘者入药、点茶、酿酒、作枕均俱佳”[5]。江浙地区中又有“黄菊宜入药，白菊宜入茶”的说法[5]，可见杭白菊除了药用，在茶用方面也是非常广泛[6]。1.2 杭白菊的国内外发展概况 杭白菊的发展从古到今已有3000多年的历史，最早的文字记载见于《尔雅》，《离骚》中也有“朝饮木兰之坠露兮，夕餐秋菊之落英”的佳句[6]。东晋有陶渊明“采菊东篱下，悠然见南山”及“秋菊有佳色，浥露掇其英”[7]的赏菊诗句。 杭白菊在我国具有悠久的栽培历史，其与安徽地区的滁菊、毫菊，河南地区的怀菊，河北地区的祁菊，山东地区的济菊，都是国内享有名誉的茶用菊[8]。杭白菊具有较高茶用价值，同时其具有延年益寿的神奇功效，《补农书》载：“甘菊性甘温，久服最有益”。元代《本草衍义补遗》中记载：菊“花能补阴”。李时珍《本草纲目》中道：“菊能朱孺之皆以服菊成仙”[9]。可见杭白菊的功效之神奇。元代时，曾用杭白菊代茶饮用，其色香味不亚于龙井茶，经常饮用，可增强毛细血管的抵抗力，抑制毛细血管的通性，具有抗炎强身的疗效[10]。 随着杭白菊产业的不断发展，目前杭白菊在我国的覆盖率达总菊花面积的38.36%，已经发展成为我国药用及茶用一体的特色产业，深受人们的欢迎[11]。1.3 杭白菊的资源分布 杭白菊的资源分布较为广泛。主要集中产于浙江桐乡、海宁、嘉兴，山东，河南等地[11]。长期以来，由于桐乡地处江南水乡平原，自然条件优越，再加上长期积累的丰富经验，1949年种植面积达14500余亩，年产384吨；1979年后，杭白菊种植不断发展，据1998年统计，全市达30000多亩，总产量达500多吨，其种植面积居全国之首位，为此，1999年桐乡被命名为“中国杭白菊之乡”。2015年桐乡的杭白菊总产量占总菊花产量的90%，目前种植地主要分布在桐乡的同福、石门、龙翔、凤鸣、梧桐等。杭白菊的种植覆盖面积越来越大，前景也越来越广，已从单纯的中药材逐渐发展到饮品，保健品等各个行业[12]。1.4 杭白菊的产地加工方法杭白菊的产地加工主要有蒸法、杀青干燥法、直接干燥法等方法。干燥方法可选用烘干法、晒干法等方法。蒸法是将杭白菊蒸5分钟，取出，置通风处晾干；蒸汽杀青法是用杀青机杀青1-2分钟，取出，置于通风处晾干；烘干法是用鼓风干燥机60℃直接烘干；晒干法是直接将杭白菊放到太阳下翻晒至干[12]。1.5 杭白菊的主要化学成分杭白菊主要含有挥发油类、黄酮类、有机酸类等化合物[13]。据统计杭白菊中黄酮类化合物有47个，主要分为三种结构类型，即黄酮类、二氢黄酮类和黄酮醇类；酚酸类中有19个化合物；包括绿原酸、咖啡酰基奎宁酸和咖啡酰基阿魏酸类等；三萜类有30个化合物，主要分为蒲公英甾醇型、齐敦果酸型、乌苏烷型[14]。1.5.1 挥发油类 杭白菊中的挥发油具有特殊浓郁的气味，主要含单萜和倍半萜及其含氧衍生物，如，樟脑、龙脑、乙酸龙脑、桉叶油素、对聚花伞素、姜黄烯、石竹烯、金合欢烯、氧化石竹烯、α-杜松醇、杜松脑、冰片脂、芳樟醇、α-侧柏酮烯、β-菲兰烯、χ-菲兰烯、γ松油烯、叔丁基苯、χ萜品烯、浦勒烯、优葛缕酮、β-榄香烯、假紫罗酮、γ-松油醇、石竹烯、香木兰稀等[13-15]。1.5.2 黄酮类化合物黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物。它们的分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具有碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，因此又称为黄碱素[16]。(图1.1)。图1.1 黄酮类化合物的基本结构杭白菊中富含黄酮类化合物，主要含有黄酮及其苷[17]、黄酮醇及其苷，如，香草木素、木犀草素、芹菜素香、叶木素7-O-β-D葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D葡萄糖苷、刺槐苷、金合欢素、山奈酚、异泽兰黄素 等[18-20]。1.5.3 有机酸类杭白菊中广泛存在有机酸类成分[21]，主要有：绿原酸甲酯、绿原酸乙酯、隐绿原酸（4-咖啡酰基奎尼酸）、新绿原酸（5-咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸A（3,5-二咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸B（3,4-二咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸C（4,5-二咖啡酰基奎尼酸）、1-异丁酰异绿原酸C、异绿原酸C甲酯、异绿原酸A甲酯、3,4,5-三咖啡酰奎尼酸、莱蓟素（1,3-二咖啡酰基奎尼酸）、3-香豆酰奎尼，还有棕榈酸、亚油酸、硬脂酸、鞣花酸以及饱和脂肪酸等[22-24]。1.5.4 其它杭白菊中还含有多糖和微量元素的成分，如，正戊基呋喃果糖、纯多糖等多糖成分；Fe、Zn、Me、Se、Cu等微量成分。除此之外还含有氨基酸类、及鞣质类化合物[25]。1.6 杭白菊的主要药理活性1.6.1 抗菌、抗炎作用 李英霞等[26]发现杭白菊制剂对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、绿脓杆菌、霍乱孤菌及人型结核杆菌等均有不同程度的抑制作用。殷红[27]等采用体外抗菌法、小鼠耳壳二甲苯肿胀法、角叉菜胶致大鼠足趾肿胀法，观察不同浓度和剂量的杭白菊挥发油对细菌和炎症的影响，并检测PGEZ的含量。结果发现杭白菊挥发油对多种常见感染菌都具有明显的抗菌活性。1.6.2 抗氧化作用秦卫东[28]用不同有机溶剂提取杭白菊中的抗氧化物质，通过实验发现，黄酮类和酚类是杭白菊的主要抗氧化成分。朱妙等[29]以杭白菊、柏皮、豆渣的超声提取物为研究对象，通过油脂氧化实验和清除自由基作用体系，分析比较了三者抗氧化活性，结果发现，柏皮、豆渣和杭白菊的乙醇提取液中都含有一定的抗氧化成分。苏祝成[30]等通过杭白菊浸液对光照核黄素的作用实验，结果发现在实验中产生的超氧化物阴离子自由基有明显的清除作用，杭白菊清除自由基的能力与其多酚类及黄酮类物质的含量有关。于善凯[31]等在对4种桐乡产杭白菊(大洋菊、软梗小洋菊、早小洋菊、异种大白菊)清除自由基的能力进行研究时发现，菊花中含有的萜类和多糖等组分，具有抗自由基和抗氧化活性的作用。方雪玲[32]等对小牛血管平滑肌细胞的凋亡及其抗氧化性进行了研究，结果显示杭白菊醇提液具有抑制小牛VSMC(血管平滑肌细胞)凋亡及促使VSMC培养液SOD值升高、MDA值下降的作用。范广勤[33]等通过铅对小鼠组织脂质过氧化作用及杭白菊对其保护作用的研究，发现杭白菊有一定驱铅作用，这可能与杭白菊中含有的维生素有关。 1.6.3 心血管保护作用 蒋惠娣等[34]对杭白菊的心血管药理作用进行了研究。研究结果表明，杭白菊水提醇沉浸膏制成的制剂可以增加离体家兔、在体狗心脏的冠脉流量。徐万红[35]等应用离体灌流大鼠心脏和无血管影响条件下的离体大鼠单个心室肌细胞模型进行研究，以及沈伟桥[36]等通过杭白菊的心血管药理作用及其作用机制研究进展，均发现杭白菊具有正性肌力作用。缪利英等[37]研究发现杭白菊能明显增加正常蟾蜍心脏以及戊巴比妥钠和低钙所致心衰模型的收缩力，具有强心抗心衰作用。蒋惠娣[38]等在动物体内研究还发现杭白菊乙酸乙脂提取物具有显著的舒血管作用。1.7 杭白菊的临床主治1.7.1 偏头痛 刘炳凤[39]应用杭菊泡茶治疗偏头痛，32例病人中，康复的有23人。服用期最短半月，最长的为两个月。锡安[40]同样采用杭菊汤治疗偏头痛中，以七剂为一疗程，患者在用药两个疗程后症状都明显减轻，在96例患者中，治愈61人，有效40例，有效率达94.79%。1.7.2 眩晕 王永宪[41]以生菊花饮治疗42例。连服六剂是一疗程，结果治愈9例，有效23例。江琳[42]用菊花钩藤饮联合西药治疗眩晕，结果治愈率达93.47%，总有效率达99.8%，疗效非常可观。1.7.3 眼疾周凤建等[43]用杭菊明目饮治疗眼角膜炎，共治疗47例，结果有效率达96.03%。王衍海[44]采用菊花承气汤医治天行赤眼，用药时采用菊花汤冲服芒硝、青黛，每天早晚各一次，同时采用菊花、霜桑叶等适量煎洗双目，每日两次，早晚各一次，结果疗效显著。1.7.4 急慢性咽炎 侯润田[45]采用菊花治疗慢性咽炎300例，结果治愈率达85.46%。1.7.5 溃疡性结肠炎 林静[46]采用菊花熬汤治疗结肠炎病，治疗62例，平均治愈率达72.56%，而且菊花汤剂无副作用，复发率小。1.8 木犀草素的概述木犀草素为黄酮类化合物，多以糖苷的形式存在于多种天然植物中，如：全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、等植物中均含量丰富。其具有消炎抗菌、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒等药理活性。临床应用于止咳、祛痰、消炎、肝炎、以及治疗心血管类疾病[46]。1.8.1 木犀草素的理化性质化学名：3,4,7-四羟黄酮；别名：黄色黄素、黄示灵；化学式：C15H10O6；物理性质：黄色针状结晶，熔点(328-330℃)，微溶于水，具弱酸性，可溶于碱性溶液[45]。1.8.2 木犀草素的来源木犀草素在自然界中分布广泛，最初是从木犀草科木犀草属的草本植物木犀草的叶、茎、枝中分离得到的，目前主要存在于金银花、菊花、白毛夏枯草、洋蓟、紫苏属、黄苓属、落花紫珠、筋骨草、百里香草等天然药材中[45]。1.8.3 木犀草素的提取工艺1.8.3.1 药材预处理将含有木犀草素的药材，经过洗涤，干燥后，粉碎成粗粉备用[47]。1.8.3.2 提取纯化药材粉末加入甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，回流提取，提取液减压浓缩后以石油醚、环己烷等溶剂萃取脱脂，水相过弱极性的大孔吸附树脂，用水洗涤至流出液无色后，以95%乙醇为洗脱剂洗脱，洗脱液减压浓缩、真空干燥并重结晶后得到木犀草素纯品[46-47]。 1.8.4 木犀草素的药理活性1.8.4.1 抗炎 实验研究发现木犀草素的抗炎活性与抑制一氧化氮(NO)和其他炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的产生有关，同时可抑制蛋白质络氨酸的磷酸化以及核转录因子KB(NF-KB)介导的基因表达[46]。1.8.4.2 抗肿瘤 通过研究木犀草素对肿瘤细胞的影响实验[46]，结果发现木犀草素可以选择性抑制前列腺癌和乳腺癌细胞的脂肪酸合成酶活性，抑制肿瘤细胞增长和变异；木犀草素可以显著的降低二甲肼所致的结肠癌的发生率，并且可调节脂质过氧化、抗氧化、抗增殖的作用；木犀草素抑制卵巢癌细胞的侵袭运动能力，与其抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的分泌及下调细胞外信号调节激酶2(ERK2)的表达有关[47]。 1.8.4.3 抗过敏 木犀草素可以抑制免疫球蛋白E介导人的肥大细胞产生的变态反应递质，包括组胺、白三烯、前列腺素D2，以及单核巨噬细胞集落刺激因子的释放，其作用还可以抑制Ca2+内流和蛋白激酶C(PKC)易位的活化[48]。 1.8.4.4 抗氧化 通过木犀草素体外实验，发现木犀草可以保护少突胶质细胞抵抗过氧化氢诱导的氧化损害，强烈抑制巨噬细胞对髓鞘的吞噬作用，显著减少细胞活性氧簇的产生，减少蛋白质活性的表达[49]。1.8.4.5 抗纤维化 木犀草素可以降低肝纤维化，降低肝组织中羟脯氨酸(HYP)、丙二醛(MDA)的含量以及I型前胶原mRNA的表达，还可以抑制肝星状细胞(HSC)的增殖和胶原合成，并可改善博来霉素所致的肺纤维化组织病理学改变，降低肺重量指数、明显降低MDA、升高HYP，抑制肺组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA的表达，抑制人胚肺纤维细胞的增殖，促进其凋亡[50]。 1.8.4.6 抗激素作用 木犀草素具有显著的抗着床活性，口服后能明显增加子宫的重量、直径、子宫内膜的厚度以及其上皮细胞的高度，单独应用时具有类雌激素作用，但和炔雌醇合用时却显示具有抗雌激素作用[51]。 1.8.4.7 对血管的作用 木犀草素可以抑制血管内皮生长因子（VEGF）诱导的兔角膜血管的生成；可以抑制鼠异种移植肿瘤模型的肿瘤生长和血管形成；可以抑制VEGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞的存活和增殖[51]；可以显著抑制血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）诱导的血管平滑肌细胞的增殖和DNA合成；可以阻滞细胞周期的进行；可以降低肾上腺素预收缩血管的张力，拮抗高钾引起的血管收缩，具有动脉舒张作用，其作用机制与直接抑制电压依从性钙通道、受体操纵性钙通道、细胞内钙释放有关[52]。 1.8.4.8 其他 木犀草素可以抑制多种细菌和病毒，如金黄色葡球菌、大肠杆菌、单纯疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒等[53]。其能抑制艾滋病病毒HIV整合酶的活性,具有潜在的抗HIV的作用。木犀草素还可以与严重急性呼吸道综合征（SARS）冠状病毒的S2蛋白结合，从而抑制病毒进入宿主细胞。1.9 高效液相色谱法的概述 高效液相色谱法又称为层析法，从1985年《中国药典》开始使用，其发展迅速，目前已以成为天然药物中有效成分的含量测定和成分分析的重要方法之一。高效液相色谱法因为其性质稳定、可靠、选择性高、灵敏度高的优点，在药用物质的含量测定和组成分析，以及质量控制方面得到了广泛的应用[54]。 色谱法的分离原理：是各组分溶于液相中，经过固定相时，与固定相发生作用大小、强弱不同，就会使其在固定相中滞留时间不相同，因此出柱先后不同，进而形成不同的峰高[55]。 高效液相色谱（HPLC）是在色谱条件的基础上，通过改进填料颗粒度大小和柱压的高低，再在传统液相色谱的基础上引入气相色谱的理论塔板数，同时在技术上引进了高压输液泵，高效的固定相和高灵敏度的检测器使其分析速度快，分离程度高，操作的半自动化强[54]。 高效液相色谱法的特点：①高压强：流动相为液体，流经色谱柱时，受到较大的阻力时，为了迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。②高效率：分离效能高，可选择最佳固定相和流动相以达到最好的分离效果。③高灵敏度：主要表现在紫外检测器的高精密度和准确性。④应用较广泛：百分之七十八以上的有机化合物都可采用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物的分离分析，占据优势。⑤分析速度快、载液流速快：较传统液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等特点，但其也存在着缺点，高效液相色谱的缺点是“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低[55]。2 实验研究2.1 仪器和试剂2.1.1 仪器Waters e2695-2996高效液相色谱系统；Empower工作站（Waters公司）；Diamonsil C18 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；DJ-02型中药粉碎机（上海淀久机械制造公司），KQ5200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。2.1.2 试剂木犀草素（购于中国食品药品鉴定研究院，批号为：111520-201304）；乙腈（Fisher)；娃哈哈纯净水，其它试剂为分析纯。 杭白菊为2015年购于陕西康盛堂药业有限公司，经陕西国际商贸学院雷国莲教授鉴定为菊科植物菊花Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥花蕾。2.2 实验方法2.2.1 色谱条件Diamonsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸（28: 72），流速1 mL·min-1；进样量10 μL；柱温25℃；检测波长340 nm，结果见图2.1，图2.2。图2.1 木犀草素样品HPLC色谱图图2.2 木犀草素对照品HPLC色谱图2.2.2 对照品溶液制备精密称取木犀草苷对照品适量，用甲醇溶解并定容，制成含有对照品0.182mg·mL-1的混标溶液，摇匀，置4℃备用，即得对照品溶液。2.2.3 供试品溶液的制备 称取杭白菊样品（过40目筛）0.5 g，精密加入60%甲醇20 mL，称定，超声处理30 min（功率100，温度25℃），补足减失重量，过0.22 um微孔滤膜，放置4℃备用，作为供试品溶液。2.2.4 线性关系考察分别精密量取木犀草素对照品溶液 2.5、5.0、7.5、10、 15、20 uL，注入到高效液相色谱仪，进行测定。按照2.2.1项下的色谱进条件进行，测定峰面积，以木犀草素对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，y=26162x-15.788，R2=1.0000。结果表明0.07312-0.5484 μg内木犀草素峰面积Y与进样量（μg）X线性关系良好。结果如表2.1和图2.3。表2.1 线性关系考查表进样量22.557.5101520峰面积5232106540301307030196205261705392411523210图2.3 木犀草素标准曲线表2.2.5 精密度试验 精密吸取木犀草素对照品溶液10 uL，注入高效液相色谱仪中，连续进样6次，测定峰面积，结果表明，RSD为0.5%，结果如表2.2所示。表2.2 精密度试验实验编号123456RSD（%）峰面积2617052617152617122616782617122617090.5%2.2.6 重复性试验分别精密称取杭白菊样品适量，平行6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算木犀草素的平均含量为0.43mg·g-1，RSD为0.29%，结果如表2.3所示。表2.3 重复性试验实验编号123456RSD（%）峰面积3176315631693181317231790.29%2.2.7 稳定性试验 按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h内重复进样6次，按照2.2.1项下的色谱条件进行，测定峰面积，结果表明，RSD为 0.45%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。结果如表2.4所示。表2.4 稳定性试验测定时间（h）02481224RSD（%）峰面积3176316831973181 319431600.45%2.2.8 加样回收率试验 精密称取杭白菊样品6份，分别加入木犀草素对照品适量，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下的色谱条件进行，测定峰面积，计算回收率。结果平均回收率为99.9%，RSD为0.88%，结果见表2.5所示。表2.5 回收率实验结果（n=6）序号样品含量/mg对照品加入量/mg实测值回收率/%平均回收率RSD/%10.4880.4550.94099.499.90.8820.4580.4550.90999.230.4620.4550.91499.540.4380.4550.895100.550.4280.4550.889101.460.4460.4550.89899.32.2.9 样品的测定 取3批杭白菊样品， 按供试品溶液制备方法及含量测定方法测定其含量，结果见表2.6。表2.6 杭白菊样品含量测定结果（n=3）批号木犀草素含量（ mg·g-1）15010.48815020.40815030.463平均值0.4532.3 讨论（1）在杭白菊木犀草素测定中，本实验采用不同比例含量的甲醇、乙醇进行提取，结果发现60%甲醇的提取率最高；对提取方法进行比较发现，超声提取法的提取率较高，而回流提取法提取率较低，因此本文采用60%甲醇，超声提取30min对杭白菊中的木犀草素进行含量测定的提取方法。（2）参考文献资料，对杭白菊中的木犀草素的含量测定方法进行比较，发现HPLC法较为简单、快速、准确。同时对色谱条件进行比较筛选。分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸进行比较发现以乙腈-0.1%甲酸为洗脱溶剂，所得色谱图较好，峰的分离度较高；因此，最终确定以乙腈-0.1%甲酸（28: 72）为本实验的流动相。 结 论本文是采用HPLC测定杭白菊中木犀草素的含量，通过实验结果可以得出，木犀草素在0.7312-0.5484 μg范围内线性关系良好；精密度(RSD=0.5%）、重复性（RSD=0.29%）、稳定性（RSD=0.45%）均良好；木犀草素的平均回收率99.9%，RSD=0.88%(n=6)，表明回收率良好；木犀草素样品的含量测定，平均含量为0.453 mg·g-1。 本实验建立的HPLC检测方法快速简便、可靠易行、准确度、精密度、稳定性均良好，可用于杭白菊的质量控制，为评价的杭白菊的质量提供理论依据。参考文献[1] 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