碱法水解制备甘草次酸初步研究(附件)
目的 本文旨在建立甘草次酸的碱法制备。方法 采用甘油、1,3-丁二醇等作为溶剂，碱性、常压、高温等条件下将甘草提取物中甘草酸转化为甘草次酸，并用薄层色谱和高效液相色谱进行分析检测。结果 甘油、1,3-丁二醇两种溶剂体系对应的甘草次酸转化率分别为2.56%、2.37%，发现甘油作溶剂优于1,3-丁二醇作溶剂；120℃、130℃、140℃、150℃四种温度条件对应的甘草次酸转化率分别为3.7%、4.06%、5.08%、3.94%，发现140℃条件下转化最优。结论 碱法水解可将甘草提取物中甘草酸转化成甘草次酸，为一种新型制备甘草次酸方法，但仍有待进一步深入研究。关键词 碱法制备，甘草酸，甘草次酸，薄层色谱，高效液相色谱
目 录
1 引言 1
1.1 甘草次酸的结构性质及来源 1
1.2 甘草次酸的制备方法 2
1.3 甘草次酸的含量测定方法 4
1.4 甘草次酸的功能和应用前景 5
1.5 立题目的、研究内容及意义 7
2 实验部分 8
2.1 实验仪器及材料 8
2.2 分析方法的建立 9
2.3 碱法制备方案 10
2.4 转化率测定 11
3 结果与讨论 11
3.1 分析方法的确立 11
3.2 转化率分析 15
3.3 碱法制备结果 18
结 论 19
致 谢 20
参考文献 21
1 引言
1.1 甘草次酸的结构性质及来源
1.1.1 甘草次酸的结构
甘草次酸的中文系统命名：3羟基11氧代齐墩果12烯29酸，英文名：glychrrhetinic acid，别名甘草亭酸，分子式C30H46O4，结构见图1。它是一种白色结晶型粉末，易溶于氯仿，溶于乙醇、乙酸、吡啶，不溶于水、石油醚，甜度远大于蔗糖，熔点为220℃，水溶液呈弱酸性。
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图1 甘草次酸的结构
1.1.2 甘草次酸的性质
甘草次酸是一种典型的五环三萜类齐墩果烷型化合物，其结构决定了其 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
理化性质。甘草次酸结构中共轭双键使得其在紫外可见光区有明显的吸收，且它的18CH有两种构型决定其具有18α和18β型两种光学异构体，使得其在紫外光谱图上的不同，若18CH为α型，其紫外吸收峰λ为242~243 nm，若18CH为β型，其紫外吸收峰λ为248~249 nm；甘草次酸3位OH可与醋酐发生傅克酰基化反应，生成的乙酰甘草次酸同样具有较强的药理活性，且3位OH脱水后形成双键，再经双键移位、双分子缩合后形成共轭双键，加上结构中本身含有的共轭双键使得可与醋酐浓硫酸、亚甲蓝试剂迅速显色；甘草次酸30位COOH可与NaOH、KOH等碱性试剂发生酸碱反应。
1.1.3 甘草次酸的来源
甘草次酸广泛存在于各种甘草中，比如云南甘草、光果甘草、乌拉尔甘草等，其含量低至0.01~0.2% 之间，却是中药甘草中一种有效的活性成分；另外，甘草次酸也是甘草中另一种活性成分甘草酸的苷元，故可通过甘草酸或其盐在一定条件下脱去两分子葡萄糖醛酸制得，反应式见图2。
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甘草酸或其盐（R为H、K、NH4） 甘草次酸
图2 甘草酸或其盐与甘草次酸
1.2 甘草次酸的制备方法
1.2.1 溶剂萃取法
付玉杰[1]等采用超临界CO2萃取法从甘草中萃取甘草次酸，发现了最适工艺条件，即压力为30 MPa，温度为45℃，时间为2 h，原料粒度为70目，夹带剂为80% 乙醇，结果发现超临界CO2萃取法优于其他几种方法，但是甘草中的甘草次酸含量太低，大约在0.01~0.2%，利用效率低下，浪费宝贵的甘草资源。
1.2.2 酸水解法
酸化水解的基本流程是：由甘草酸或其盐在酸性条件下水解得到粗甘草次酸，再用氯仿萃取后用乙醇溶解或者用氧化铝柱层析，然后用活性炭脱色，最后加水析晶得甘草次酸精品。
曾启华[2]采用水酸提取法从甘草中提取粗甘草酸，经过D101大孔树脂活化后加0.5% H2SO4溶液，在耐压密封套管中维持120℃反应16 h，等到自然冷却后用氯仿萃取，最后经冰醋酸重结晶得到甘草次酸晶体，产率为4% 左右。赵剑宇[3]采用水加乙醇加浓硫酸体系对甘草酸粗品水解，发现比水加硫酸体系具有明显优越性。刘刚等将甘草酸经盐酸水解后，冷却过滤，洗涤干燥，再用氯仿萃取，浓缩，用乙醇溶解，最后经脱色后重结晶得甘草次酸精品。酸化水解虽然工艺简单，但是反应条件苛刻，需要在高温高压下水解，反应产物常常会发生脱水、环合、双键转移等变化，副产物多，产率低。
1.2.3 碱水解法
碱化水解的基本原理和酸化水解类似，不同点在于甘草酸在碱性条件下，如氨水等，一方面将甘草酸转化为甘草酸氨盐，改变其电离状态，提高水溶性；另一方面有利于甘草酸进一步水解生成甘草次酸。
目前还没有学者研究甘草次酸的碱法水解，但是皂苷类（比如西洋参茎叶皂苷、人参皂苷等）的碱法降解在文献中有报道，如李绪文[4]采用强碱水溶液和强碱甘油溶液对西洋参总人参皂苷降解并确立了各方法的最佳降解条件，发现强碱甘油溶液下20S原人参二醇转化率最高，最佳降解条件为：NaOH/西洋参茎叶总皂苷质量比为2.0:1（w/w，g/g），甘油/西洋参茎叶总皂苷质量比为15.0:1(v/w，mL/g)，在235℃条件下反应200 min，此时降解转化率可达85.93%。甘草酸同样也是皂苷类化合物，可以借鉴此条件水解掉两个葡萄糖醛酸，得到甘草酸苷元——甘草次酸，但甘草次酸在碱性条件易变成甘草次酸盐，此时需要通过阳离子交换柱或者调节PH的方法让甘草次酸盐转化为甘草次酸。
1.2.4 乙酰水解法
乙酰水解法基本流程是甘草酸在酸酐为溶液、浓硫酸为催化剂下反应生成乙酰甘草次酸，再在碱性环境脱乙酰基变成甘草次酸钠，最后在酸性环境下脱钠变成甘草次酸。
徐静[5]以甘草酸单铵盐为底物，首次在醋酸水硫酸=46:46:8的反应体系中一步合成了乙酰甘草次酸，并对其做了抑菌测试，此方法已经在工业生产中得到大量运用。
1.2.5 酶解法
微生物发酵技术日益进步，很多学者纷纷利用微生物产酶催化水解甘草酸来制备甘草次酸。陈永强[6]等在大量发酵酶解工艺中获得了一种系统定向反馈优化方法，该工艺最佳条件是：发酵时间4 d，酶解时间16 h，酶解温度30℃，酶促PH值5.0，该法可行性高、转化率好；杜锐[7]比较各种工艺的参数条件，发现摇瓶培养时甘草酸转化率达78.62%，而种子罐比摇瓶培养发酵所获得生物量高出33%，用20 L种子罐进行发酵酶解，甘草次酸转化率为77.34%，而200 L种子罐则达74.72%；D.H Kim[8]等发现LJ22链球菌所含的β葡萄糖醛酸酶催化甘草酸转化为18β甘草次酸；孙秀梅[9]等分别用半仿生提取法（SBE法）和水提法（WE法）比较甘草次酸、甘草总黄酮、浸膏量，发现SBE法明显优于WE法；魏元刚在多孔陶瓷球柱床上用β葡萄糖醛酸酶催化甘草酸转化为甘草次酸。酶解法反应条件温和，但是反应周期长、工艺过程复杂，另外酶制剂比较昂贵。
目 录
1 引言 1
1.1 甘草次酸的结构性质及来源 1
1.2 甘草次酸的制备方法 2
1.3 甘草次酸的含量测定方法 4
1.4 甘草次酸的功能和应用前景 5
1.5 立题目的、研究内容及意义 7
2 实验部分 8
2.1 实验仪器及材料 8
2.2 分析方法的建立 9
2.3 碱法制备方案 10
2.4 转化率测定 11
3 结果与讨论 11
3.1 分析方法的确立 11
3.2 转化率分析 15
3.3 碱法制备结果 18
结 论 19
致 谢 20
参考文献 21
1 引言
1.1 甘草次酸的结构性质及来源
1.1.1 甘草次酸的结构
甘草次酸的中文系统命名：3羟基11氧代齐墩果12烯29酸，英文名：glychrrhetinic acid，别名甘草亭酸，分子式C30H46O4，结构见图1。它是一种白色结晶型粉末，易溶于氯仿，溶于乙醇、乙酸、吡啶，不溶于水、石油醚，甜度远大于蔗糖，熔点为220℃，水溶液呈弱酸性。
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图1 甘草次酸的结构
1.1.2 甘草次酸的性质
甘草次酸是一种典型的五环三萜类齐墩果烷型化合物，其结构决定了其 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
理化性质。甘草次酸结构中共轭双键使得其在紫外可见光区有明显的吸收，且它的18CH有两种构型决定其具有18α和18β型两种光学异构体，使得其在紫外光谱图上的不同，若18CH为α型，其紫外吸收峰λ为242~243 nm，若18CH为β型，其紫外吸收峰λ为248~249 nm；甘草次酸3位OH可与醋酐发生傅克酰基化反应，生成的乙酰甘草次酸同样具有较强的药理活性，且3位OH脱水后形成双键，再经双键移位、双分子缩合后形成共轭双键，加上结构中本身含有的共轭双键使得可与醋酐浓硫酸、亚甲蓝试剂迅速显色；甘草次酸30位COOH可与NaOH、KOH等碱性试剂发生酸碱反应。
1.1.3 甘草次酸的来源
甘草次酸广泛存在于各种甘草中，比如云南甘草、光果甘草、乌拉尔甘草等，其含量低至0.01~0.2% 之间，却是中药甘草中一种有效的活性成分；另外，甘草次酸也是甘草中另一种活性成分甘草酸的苷元，故可通过甘草酸或其盐在一定条件下脱去两分子葡萄糖醛酸制得，反应式见图2。
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甘草酸或其盐（R为H、K、NH4） 甘草次酸
图2 甘草酸或其盐与甘草次酸
1.2 甘草次酸的制备方法
1.2.1 溶剂萃取法
付玉杰[1]等采用超临界CO2萃取法从甘草中萃取甘草次酸，发现了最适工艺条件，即压力为30 MPa，温度为45℃，时间为2 h，原料粒度为70目，夹带剂为80% 乙醇，结果发现超临界CO2萃取法优于其他几种方法，但是甘草中的甘草次酸含量太低，大约在0.01~0.2%，利用效率低下，浪费宝贵的甘草资源。
1.2.2 酸水解法
酸化水解的基本流程是：由甘草酸或其盐在酸性条件下水解得到粗甘草次酸，再用氯仿萃取后用乙醇溶解或者用氧化铝柱层析，然后用活性炭脱色，最后加水析晶得甘草次酸精品。
曾启华[2]采用水酸提取法从甘草中提取粗甘草酸，经过D101大孔树脂活化后加0.5% H2SO4溶液，在耐压密封套管中维持120℃反应16 h，等到自然冷却后用氯仿萃取，最后经冰醋酸重结晶得到甘草次酸晶体，产率为4% 左右。赵剑宇[3]采用水加乙醇加浓硫酸体系对甘草酸粗品水解，发现比水加硫酸体系具有明显优越性。刘刚等将甘草酸经盐酸水解后，冷却过滤，洗涤干燥，再用氯仿萃取，浓缩，用乙醇溶解，最后经脱色后重结晶得甘草次酸精品。酸化水解虽然工艺简单，但是反应条件苛刻，需要在高温高压下水解，反应产物常常会发生脱水、环合、双键转移等变化，副产物多，产率低。
1.2.3 碱水解法
碱化水解的基本原理和酸化水解类似，不同点在于甘草酸在碱性条件下，如氨水等，一方面将甘草酸转化为甘草酸氨盐，改变其电离状态，提高水溶性；另一方面有利于甘草酸进一步水解生成甘草次酸。
目前还没有学者研究甘草次酸的碱法水解，但是皂苷类（比如西洋参茎叶皂苷、人参皂苷等）的碱法降解在文献中有报道，如李绪文[4]采用强碱水溶液和强碱甘油溶液对西洋参总人参皂苷降解并确立了各方法的最佳降解条件，发现强碱甘油溶液下20S原人参二醇转化率最高，最佳降解条件为：NaOH/西洋参茎叶总皂苷质量比为2.0:1（w/w，g/g），甘油/西洋参茎叶总皂苷质量比为15.0:1(v/w，mL/g)，在235℃条件下反应200 min，此时降解转化率可达85.93%。甘草酸同样也是皂苷类化合物，可以借鉴此条件水解掉两个葡萄糖醛酸，得到甘草酸苷元——甘草次酸，但甘草次酸在碱性条件易变成甘草次酸盐，此时需要通过阳离子交换柱或者调节PH的方法让甘草次酸盐转化为甘草次酸。
1.2.4 乙酰水解法
乙酰水解法基本流程是甘草酸在酸酐为溶液、浓硫酸为催化剂下反应生成乙酰甘草次酸，再在碱性环境脱乙酰基变成甘草次酸钠，最后在酸性环境下脱钠变成甘草次酸。
徐静[5]以甘草酸单铵盐为底物，首次在醋酸水硫酸=46:46:8的反应体系中一步合成了乙酰甘草次酸，并对其做了抑菌测试，此方法已经在工业生产中得到大量运用。
1.2.5 酶解法
微生物发酵技术日益进步，很多学者纷纷利用微生物产酶催化水解甘草酸来制备甘草次酸。陈永强[6]等在大量发酵酶解工艺中获得了一种系统定向反馈优化方法，该工艺最佳条件是：发酵时间4 d，酶解时间16 h，酶解温度30℃，酶促PH值5.0，该法可行性高、转化率好；杜锐[7]比较各种工艺的参数条件，发现摇瓶培养时甘草酸转化率达78.62%，而种子罐比摇瓶培养发酵所获得生物量高出33%，用20 L种子罐进行发酵酶解，甘草次酸转化率为77.34%，而200 L种子罐则达74.72%；D.H Kim[8]等发现LJ22链球菌所含的β葡萄糖醛酸酶催化甘草酸转化为18β甘草次酸；孙秀梅[9]等分别用半仿生提取法（SBE法）和水提法（WE法）比较甘草次酸、甘草总黄酮、浸膏量，发现SBE法明显优于WE法；魏元刚在多孔陶瓷球柱床上用β葡萄糖醛酸酶催化甘草酸转化为甘草次酸。酶解法反应条件温和，但是反应周期长、工艺过程复杂，另外酶制剂比较昂贵。
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