微波辅助提取瞿麦中黄酮的工艺研究(附件)
摘 要本文以陕产瞿麦为原料，采用响应面法优化瞿麦黄酮微波辅助提取工艺。考察了料液比、提取时间、微波功率对提取工艺的影响，在单因素实验分析的基础上采用Box-Benhnken法，以瞿麦黄酮得率为响应值，进行响应面分析，建立二次多项回归数学模型，并优化提取工艺。结果表明料液比为1:50，提取时间为2min，微波功率为600W时瞿麦黄酮的提取率为1.04%。
目 录
1 概述 1
1.1 研究目的和意义 1
1.2 瞿麦的概述 1
1.3 瞿麦中黄酮类化合物的药理作用 1
1.3.1 抗氧化、消除自由基作用 1
1.3.2 免疫调节作用 2
1.3.3 减轻血管内皮单层通透性增加作用 2
1.3.4 抗病毒作用 2
1.3.5 抗癌抗肿瘤的作用 2
1.4 黄酮的提取方法 3
1.4.1 超声波提取法 3
1.4.2 微波提取法 3
1.4.3 超临界流体萃取法 3
1.4.4 酶法提取 4
1.4.5 双水相提取法 4
2 实验部分 5
2.1 实验材料与仪器 5
2.2 标准溶剂的配制 5
2.2.1 试剂配制 5
2.2.2 波长的选择 6
2.2.3 标准曲线的绘制 6
2.3方法学考察 6
2.3.1 重复性试验 6
2.3.2 稳定性试验 6
2.3.3 精密度试验 6
2.3.4 加样回收率试验 6
2.3.5 瞿麦黄酮的提取工艺 7
2.4 单因素实验 7 2.4.1 提取时间对黄酮得率的影响 7
2.4.2 微波功率对黄酮得率的影响 7
2.4.3 料液比对黄酮得率的影响 7
2.5 瞿麦黄酮的得率计算 7
2.6 响应曲面设计 7
3 实验结果与分析 9
3.1 芦丁标准曲线的绘制 9
3.2 方法学考察结果 9
3.2.1重复性试验 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
9
3.2.2 稳定性试验 10
3.2.3 精密度试验 10
3.2.4 回收率试验 10
3.3 单因素的实验结果 11
3.3.1 提取时间对瞿麦黄酮得率的影响 11
3.3.2 微波功率对瞿麦黄酮得率的影响 11
3.3.3 料液比对瞿麦黄酮得率的影响 12
3.4 响应面试验及结果分析 13
3.4.1 响应曲面法试验 13
3.4.2 响应曲面法 13
3.4.3 模型方差分析 15
3.4.4各因素对提取率影响的响应面图 16
3.4.5 响应面试验结果验证 17
3.4.6结果与分析 17
结 论 19
参考文献 20
致 谢 22
1 概述
1.1 研究目的和意义
通过查资料，与以往的研究方法进行比较发现，在此之前还没有采用过微波提取黄酮的方法提取过瞿麦中的黄酮。因此，本论文中采用微波提取黄酮的方法提取瞿麦中的黄酮。该方法除了得率高，提取时间短等优势外，与其它方法相比还具有实验重复性好，被提取物结构不易被破坏,设备投资少、能耗小等优点[1]。微波提取瞿麦中总黄酮的最优工艺条件,通过响应曲面法，优选出最佳工艺条件。本文中主要对瞿麦中总黄酮的提取工艺进行优化研究,为进一步高效合理的利用瞿麦资源提供依据。
1.2 瞿麦的概述
瞿麦为石竹科植物,全国大部分地区有分布。具有利尿,破血通经的功效，用于热淋、血淋、石淋、月经不止等症。《本草备要》说：“降心火，利小肠，逐膀胱邪热，为治淋要药”。据国内外的文献报道，目前从瞿麦中分离得到的化合物主要有黄酮类、环肽类、皂苷类和蒽醌类成分[2]。瞿麦中总黄酮含量较高,其利用价值也较高。总黄酮具有抗氧化作用、抑菌作用、抗肿瘤等作用。因此，瞿麦的开发与利用,对利尿通淋、破血痛经等具有重要意义。
1.3 瞿麦中黄酮类化合物的药理作用
1.3.1 抗氧化、消除自由基作用
自由基是一类在外层电子轨道上含有单个不配对电子的原子、原子团和分子,病理情况下，由于活性氧生成过多或机体抗氧化能力不足，可引起氧化应激反应，导致细胞损伤甚至死亡。国内对瞿麦清除自由基、减轻氧化应激损伤的作用机制非常重视。汪德清等用扑热息痛给小鼠灌胃，实验表明瞿麦黄酮(TFA)具有良好的抗扑热息痛所致肝组织损伤作用，其效果与TFA浓度成正比；其抗扑热息痛所致肝损伤的作用机制可能与清除代谢过程中产生的自由基有关[3]。
沈文梅等[4]以大鼠肝脏缺血一再灌注为模型，观察失血性休克再灌注后血清转氨酶活性，血气指标的动态变化和黄茂黄酮对这些指标的影响。研究结果表明:失血性休克再灌注后可导致肝损伤和血气指标变化，瞿麦黄酮对缺血再灌损伤具有一定的防护作用，其作用机理可能主要是通过清除缺血再灌注过程中产生的人量自由基实现的。
从陕产瞿麦中提取的异黄酮类化合物有抗氧化作用,经预处理的PC12细胞，可增强抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)的活性,并可能通过稳定细胞膜结构来抑制谷氨酸盐引起的细胞损伤。
1.3.2 免疫调节作用
焦艳等[5]实验发现膜荚瞿麦黄酮能增加氢考(HC)模型小鼠脾脏的质量；增加抗体形成细胞的数量；增强单核巨噬细胞的吞噬功能，表明陕产瞿麦黄酮对机体非特异性免疫及特异性体液免疫具有增强作用。杨风华等[6]采用“细胞毒”法和“MTT”法，发现黄芪黄酮能提高氢考(HC)致免疫功能低下小鼠T细胞总数，促进刀豆蛋白诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖，且本身具有丝裂原的作用，表明黄芪黄酮对细胞免疫功能具有促进作用。
1.3.3 减轻血管内皮单层通透性增加作用
血管内皮通过产生和释放多种体液因子在局部血流动力学，及血管内细胞的黏附方面起重要作用。吴大正等[7]制备小牛主动脉内皮细胞(EC)单层低渗模型进行实验,表明TFA、毛蕊异黄酮能够减轻低渗造成的内皮单层通透性的增加，对低渗造成的EC单层通透性增加具有改善作用,其改善作用类似于白蛋白。
1.3.4 抗病毒作用
王志杰等[8]用人疱疹病毒HSV 1、HS 1株感染豚鼠皮肤，结果显示TFA治疗豚鼠皮肤HSV 1感染的效果与ACV相近。也有报道将黄芪黄酮、黄芪多糖等多种中药成分与鸡传染性法氏囊病毒加入到培养24h的鸡胚成纤维细胞中,结果提示,先加中药后接种病毒和中药与病毒同时加入时，多数中药成分处理组在病毒接种后72 h明显减轻,表明多数中药能抑制病毒感染细胞，且有一定的量效和时效关系。其中，黄芪黄酮抑制病毒感染作用显著。
目 录
1 概述 1
1.1 研究目的和意义 1
1.2 瞿麦的概述 1
1.3 瞿麦中黄酮类化合物的药理作用 1
1.3.1 抗氧化、消除自由基作用 1
1.3.2 免疫调节作用 2
1.3.3 减轻血管内皮单层通透性增加作用 2
1.3.4 抗病毒作用 2
1.3.5 抗癌抗肿瘤的作用 2
1.4 黄酮的提取方法 3
1.4.1 超声波提取法 3
1.4.2 微波提取法 3
1.4.3 超临界流体萃取法 3
1.4.4 酶法提取 4
1.4.5 双水相提取法 4
2 实验部分 5
2.1 实验材料与仪器 5
2.2 标准溶剂的配制 5
2.2.1 试剂配制 5
2.2.2 波长的选择 6
2.2.3 标准曲线的绘制 6
2.3方法学考察 6
2.3.1 重复性试验 6
2.3.2 稳定性试验 6
2.3.3 精密度试验 6
2.3.4 加样回收率试验 6
2.3.5 瞿麦黄酮的提取工艺 7
2.4 单因素实验 7 2.4.1 提取时间对黄酮得率的影响 7
2.4.2 微波功率对黄酮得率的影响 7
2.4.3 料液比对黄酮得率的影响 7
2.5 瞿麦黄酮的得率计算 7
2.6 响应曲面设计 7
3 实验结果与分析 9
3.1 芦丁标准曲线的绘制 9
3.2 方法学考察结果 9
3.2.1重复性试验 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
9
3.2.2 稳定性试验 10
3.2.3 精密度试验 10
3.2.4 回收率试验 10
3.3 单因素的实验结果 11
3.3.1 提取时间对瞿麦黄酮得率的影响 11
3.3.2 微波功率对瞿麦黄酮得率的影响 11
3.3.3 料液比对瞿麦黄酮得率的影响 12
3.4 响应面试验及结果分析 13
3.4.1 响应曲面法试验 13
3.4.2 响应曲面法 13
3.4.3 模型方差分析 15
3.4.4各因素对提取率影响的响应面图 16
3.4.5 响应面试验结果验证 17
3.4.6结果与分析 17
结 论 19
参考文献 20
致 谢 22
1 概述
1.1 研究目的和意义
通过查资料，与以往的研究方法进行比较发现，在此之前还没有采用过微波提取黄酮的方法提取过瞿麦中的黄酮。因此，本论文中采用微波提取黄酮的方法提取瞿麦中的黄酮。该方法除了得率高，提取时间短等优势外，与其它方法相比还具有实验重复性好，被提取物结构不易被破坏,设备投资少、能耗小等优点[1]。微波提取瞿麦中总黄酮的最优工艺条件,通过响应曲面法，优选出最佳工艺条件。本文中主要对瞿麦中总黄酮的提取工艺进行优化研究,为进一步高效合理的利用瞿麦资源提供依据。
1.2 瞿麦的概述
瞿麦为石竹科植物,全国大部分地区有分布。具有利尿,破血通经的功效，用于热淋、血淋、石淋、月经不止等症。《本草备要》说：“降心火，利小肠，逐膀胱邪热，为治淋要药”。据国内外的文献报道，目前从瞿麦中分离得到的化合物主要有黄酮类、环肽类、皂苷类和蒽醌类成分[2]。瞿麦中总黄酮含量较高,其利用价值也较高。总黄酮具有抗氧化作用、抑菌作用、抗肿瘤等作用。因此，瞿麦的开发与利用,对利尿通淋、破血痛经等具有重要意义。
1.3 瞿麦中黄酮类化合物的药理作用
1.3.1 抗氧化、消除自由基作用
自由基是一类在外层电子轨道上含有单个不配对电子的原子、原子团和分子,病理情况下，由于活性氧生成过多或机体抗氧化能力不足，可引起氧化应激反应，导致细胞损伤甚至死亡。国内对瞿麦清除自由基、减轻氧化应激损伤的作用机制非常重视。汪德清等用扑热息痛给小鼠灌胃，实验表明瞿麦黄酮(TFA)具有良好的抗扑热息痛所致肝组织损伤作用，其效果与TFA浓度成正比；其抗扑热息痛所致肝损伤的作用机制可能与清除代谢过程中产生的自由基有关[3]。
沈文梅等[4]以大鼠肝脏缺血一再灌注为模型，观察失血性休克再灌注后血清转氨酶活性，血气指标的动态变化和黄茂黄酮对这些指标的影响。研究结果表明:失血性休克再灌注后可导致肝损伤和血气指标变化，瞿麦黄酮对缺血再灌损伤具有一定的防护作用，其作用机理可能主要是通过清除缺血再灌注过程中产生的人量自由基实现的。
从陕产瞿麦中提取的异黄酮类化合物有抗氧化作用,经预处理的PC12细胞，可增强抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)的活性,并可能通过稳定细胞膜结构来抑制谷氨酸盐引起的细胞损伤。
1.3.2 免疫调节作用
焦艳等[5]实验发现膜荚瞿麦黄酮能增加氢考(HC)模型小鼠脾脏的质量；增加抗体形成细胞的数量；增强单核巨噬细胞的吞噬功能，表明陕产瞿麦黄酮对机体非特异性免疫及特异性体液免疫具有增强作用。杨风华等[6]采用“细胞毒”法和“MTT”法，发现黄芪黄酮能提高氢考(HC)致免疫功能低下小鼠T细胞总数，促进刀豆蛋白诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖，且本身具有丝裂原的作用，表明黄芪黄酮对细胞免疫功能具有促进作用。
1.3.3 减轻血管内皮单层通透性增加作用
血管内皮通过产生和释放多种体液因子在局部血流动力学，及血管内细胞的黏附方面起重要作用。吴大正等[7]制备小牛主动脉内皮细胞(EC)单层低渗模型进行实验,表明TFA、毛蕊异黄酮能够减轻低渗造成的内皮单层通透性的增加，对低渗造成的EC单层通透性增加具有改善作用,其改善作用类似于白蛋白。
1.3.4 抗病毒作用
王志杰等[8]用人疱疹病毒HSV 1、HS 1株感染豚鼠皮肤，结果显示TFA治疗豚鼠皮肤HSV 1感染的效果与ACV相近。也有报道将黄芪黄酮、黄芪多糖等多种中药成分与鸡传染性法氏囊病毒加入到培养24h的鸡胚成纤维细胞中,结果提示,先加中药后接种病毒和中药与病毒同时加入时，多数中药成分处理组在病毒接种后72 h明显减轻,表明多数中药能抑制病毒感染细胞，且有一定的量效和时效关系。其中，黄芪黄酮抑制病毒感染作用显著。
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