王不留行多糖含量测定分析的方法学研究
本论文对王不留行多糖含量测定方法初步进行了方法学研究，包括王不留行多糖的样品预处理方法和含量测定分析方法。通过对直接测定、酶解、酸水解等样品预处理方法以及苯酚-硫酸法、DNS法、HPLC法的含量测定方法的方法学比较，初步建立了专属性好、准确可靠的王不留行多糖分析方法。研究结果表明，采用苯酚-硫酸法直接测定样品多糖含量为22.18%，酶解后测得的含量明显提高；DNS法测的酶解后样品多糖含量为45.52%，酸水解后为75.0%；用HPLC法测的酸水解后样品多糖含量为73.7%。HPLC法具有专属、灵敏、准确度高的特点，DNS法与HPLC法测定结果基本一致，具有操作简单、成本低、准确可靠的特点。关键词 王不留行多糖，苯酚-硫酸法，DNS法，HPLC法目 录
1 引言 1
1.1 王不留行简介 1
1.2 王不留行多糖的研究进展 1
1.2.1 多糖的结构 1
1.2.1.1 多糖的一级结构 1
1.2.1.2 多糖的高级结构 2
2 常用的多糖分析方法 2
2.1 常用的多糖水解方法 2
2.1.1 酸水解法 2
2.1.2 酶水解法 3
2.2 常用的多糖含量测定方法 3
2.2.1 苯酚-硫酸法 3
2.2.2 3，5-二硝基水杨酸（DNS）法 4
2.2.3 高效液相色谱（HPLC）法 4
3 实验 5
3.1 实验仪器和试剂 5
3.1.1 实验仪器 5
3.1.2 实验试剂 5
3.1.3 实验材料 6
3.2 实验方法 6
3.2.1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
苯酚-硫酸法 6
3.2.1.1 葡萄糖标准曲线绘制 6
3.2.1.2 苯酚-硫酸法测定多糖含量 6
3.2.2 DNS法 7
3.2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制 7
3.2.2.2 DNS法测多糖含量 8
3.2.3 HPLC法 9
3.2.3.1 色谱条件 9
3.2.3.2 HPLC法测多糖含量 9
3.3 结果分析 9
3.3.1 苯酚-硫酸法测多糖含量 9
3.3.2 DNS法测多糖含量 10
3.3.2.1 测定波长的选择 10
3.3.2.2 加热时间对测定结果的影响 10
3.3.2.3 DNS试剂用量对测定结果的影响 10
3.3.2.4 标准曲线的制备 11
3.3.2.5 样品中多糖含量测定 11
3.3.3 HPLC法测多糖含量 12
结 论 13
致 谢 14
参 考 文 献 15
1 引言
1.1 王不留行简介
王不留行为石竹科植物麦蓝菜（Vaccaria segetalis (Neck.) Garcke）的干燥成熟种子[1]。种子呈球形，直径约2mm，表面黑色，少数红棕色，略有光泽，有细密颗粒状突起，质坚硬，断面灰白色，角质样，无臭。王不留行多生长于田边或耕地附近的丘陵地，除华南外，全国各地区都有分布。王不留行是一味常用中药，味苦，性平，具有催生下乳，消肿敛疮，利水通淋等功效[2]。
1.2 王不留行多糖的研究进展
王不留行多糖是从王不留行种子中提取出来的高分子化合物。近几十年来，人们发现糖类在生物体中不仅能作为能量资源或结构材料，更重要的是它参与了生命科学中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能[3-5]。由于多糖的种类繁多，多糖含量和存在形式也多变，选择适当的多糖分析方法十分重要。本文对王不留行多糖含量测定的一些方法就行综述，为多糖的开发和利用提供科学基础。
1.2.1 多糖的结构
多糖的结构单位是单糖，结构单位之间以苷键相连接，常见的苷键有α-1，4-、β-1，4-和α-1，6-苷键[6]。多糖的结构分为初级结构和高级结构一级结构为初级结构，二、三、四级结构为高级结构。
1.2.1.1 多糖的一级结构
多糖的一级结构是指糖基的组成，相邻糖基的连接方式，糖链有无分支，分支的位置与长短，糖基排列顺序以及异头碳构型等[7]。
由糖基的组成组成情况分，多糖可分为同多糖和杂多糖。同多糖仅由一种单糖组成，如淀粉、糖原等；杂多糖由多种单糖组成，如果胶、木聚糖等。
相邻糖基的连接方式：多糖的结构单位是单糖，结构单位之间以苷键相连接，常见的苷键有α-1，4-、β-1，4-和α-1，6-苷键。表1是几种单糖基之间的不同连接方式。
按多糖连有无分支，可将多糖分为直链多糖和支链多糖。直链多糖仅含一种糖苷键，如淀粉、糖原等；支链多糖含有多种糖苷键，如糖原、支链淀粉等。
按单糖基的异头碳构型不同，可形成α-、β-型两种异头物。由于单糖的醛基、酮基与分子内的羟基形成环状半缩醛（半缩酮）结构，使得羰基碳原子变成不对称碳原子，从而产生两种差向异构体——异头物。
表1 几种单糖基之间的连接方式
双糖
单糖基
糖苷键
蔗糖
α-D-Glc
β-D-Fru
α,β-(1,2)-键
乳糖
α-D-Glc
β-D-Gal
α,β-(1,4)-键
麦芽糖
α-D-Glc
α-D-Glc
α-1,4-键
异麦芽糖
α-D-Glc
α-D-Glc
α-1,6-键
纤维二糖
β-D-Glc
β-D-Glc
β-1,4-键
1.2.1.2 多糖的高级结构
多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象。多糖的三级结构和四级结构是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象。
2 常用的多糖分析方法
2.1 常用的多糖水解方法
对于多糖的水解方法可分为化学法、物理法和生物法[8]（如表2所示），本次实验我们主要采用的是化学法中的酸水解和生物法中的酶水解法。
表2 多糖水解的方法的特点
水解方法
试剂或仪器
优点
缺点
化学法
HCl、H2SO4、H2O2等
操作简单易行、反应快、水解产率高
均一性差、破坏氨基、对环境有污染
物理法
基于葡萄糖母液B配制0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的系列葡萄糖标准溶液。用移液管分别量取上述浓度的葡萄糖标液2 mL于25 mL具塞比色管中，加 DNS试剂4 mL，摇匀，置沸水浴加热7 min，流水冷却至室温，以去离子水定容。取2.0 mL去离子水进行同样的操作作为空白对照，于540 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
1 引言 1
1.1 王不留行简介 1
1.2 王不留行多糖的研究进展 1
1.2.1 多糖的结构 1
1.2.1.1 多糖的一级结构 1
1.2.1.2 多糖的高级结构 2
2 常用的多糖分析方法 2
2.1 常用的多糖水解方法 2
2.1.1 酸水解法 2
2.1.2 酶水解法 3
2.2 常用的多糖含量测定方法 3
2.2.1 苯酚-硫酸法 3
2.2.2 3，5-二硝基水杨酸（DNS）法 4
2.2.3 高效液相色谱（HPLC）法 4
3 实验 5
3.1 实验仪器和试剂 5
3.1.1 实验仪器 5
3.1.2 实验试剂 5
3.1.3 实验材料 6
3.2 实验方法 6
3.2.1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
苯酚-硫酸法 6
3.2.1.1 葡萄糖标准曲线绘制 6
3.2.1.2 苯酚-硫酸法测定多糖含量 6
3.2.2 DNS法 7
3.2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制 7
3.2.2.2 DNS法测多糖含量 8
3.2.3 HPLC法 9
3.2.3.1 色谱条件 9
3.2.3.2 HPLC法测多糖含量 9
3.3 结果分析 9
3.3.1 苯酚-硫酸法测多糖含量 9
3.3.2 DNS法测多糖含量 10
3.3.2.1 测定波长的选择 10
3.3.2.2 加热时间对测定结果的影响 10
3.3.2.3 DNS试剂用量对测定结果的影响 10
3.3.2.4 标准曲线的制备 11
3.3.2.5 样品中多糖含量测定 11
3.3.3 HPLC法测多糖含量 12
结 论 13
致 谢 14
参 考 文 献 15
1 引言
1.1 王不留行简介
王不留行为石竹科植物麦蓝菜（Vaccaria segetalis (Neck.) Garcke）的干燥成熟种子[1]。种子呈球形，直径约2mm，表面黑色，少数红棕色，略有光泽，有细密颗粒状突起，质坚硬，断面灰白色，角质样，无臭。王不留行多生长于田边或耕地附近的丘陵地，除华南外，全国各地区都有分布。王不留行是一味常用中药，味苦，性平，具有催生下乳，消肿敛疮，利水通淋等功效[2]。
1.2 王不留行多糖的研究进展
王不留行多糖是从王不留行种子中提取出来的高分子化合物。近几十年来，人们发现糖类在生物体中不仅能作为能量资源或结构材料，更重要的是它参与了生命科学中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能[3-5]。由于多糖的种类繁多，多糖含量和存在形式也多变，选择适当的多糖分析方法十分重要。本文对王不留行多糖含量测定的一些方法就行综述，为多糖的开发和利用提供科学基础。
1.2.1 多糖的结构
多糖的结构单位是单糖，结构单位之间以苷键相连接，常见的苷键有α-1，4-、β-1，4-和α-1，6-苷键[6]。多糖的结构分为初级结构和高级结构一级结构为初级结构，二、三、四级结构为高级结构。
1.2.1.1 多糖的一级结构
多糖的一级结构是指糖基的组成，相邻糖基的连接方式，糖链有无分支，分支的位置与长短，糖基排列顺序以及异头碳构型等[7]。
由糖基的组成组成情况分，多糖可分为同多糖和杂多糖。同多糖仅由一种单糖组成，如淀粉、糖原等；杂多糖由多种单糖组成，如果胶、木聚糖等。
相邻糖基的连接方式：多糖的结构单位是单糖，结构单位之间以苷键相连接，常见的苷键有α-1，4-、β-1，4-和α-1，6-苷键。表1是几种单糖基之间的不同连接方式。
按多糖连有无分支，可将多糖分为直链多糖和支链多糖。直链多糖仅含一种糖苷键，如淀粉、糖原等；支链多糖含有多种糖苷键，如糖原、支链淀粉等。
按单糖基的异头碳构型不同，可形成α-、β-型两种异头物。由于单糖的醛基、酮基与分子内的羟基形成环状半缩醛（半缩酮）结构，使得羰基碳原子变成不对称碳原子，从而产生两种差向异构体——异头物。
表1 几种单糖基之间的连接方式
双糖
单糖基
糖苷键
蔗糖
α-D-Glc
β-D-Fru
α,β-(1,2)-键
乳糖
α-D-Glc
β-D-Gal
α,β-(1,4)-键
麦芽糖
α-D-Glc
α-D-Glc
α-1,4-键
异麦芽糖
α-D-Glc
α-D-Glc
α-1,6-键
纤维二糖
β-D-Glc
β-D-Glc
β-1,4-键
1.2.1.2 多糖的高级结构
多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象。多糖的三级结构和四级结构是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象。
2 常用的多糖分析方法
2.1 常用的多糖水解方法
对于多糖的水解方法可分为化学法、物理法和生物法[8]（如表2所示），本次实验我们主要采用的是化学法中的酸水解和生物法中的酶水解法。
表2 多糖水解的方法的特点
水解方法
试剂或仪器
优点
缺点
化学法
HCl、H2SO4、H2O2等
操作简单易行、反应快、水解产率高
均一性差、破坏氨基、对环境有污染
物理法
基于葡萄糖母液B配制0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的系列葡萄糖标准溶液。用移液管分别量取上述浓度的葡萄糖标液2 mL于25 mL具塞比色管中，加 DNS试剂4 mL，摇匀，置沸水浴加热7 min，流水冷却至室温，以去离子水定容。取2.0 mL去离子水进行同样的操作作为空白对照，于540 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
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