hplc法测定不同地区绞股蓝中rb1的含量(附件)
摘 要植物绞股蓝总皂苷中包含的成分较多，其中皂苷Rb1具有降血脂、降血糖、保护心脑血管系统、保肝护肝增强免疫力、抗血栓、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用。目前的研究资料对绞股蓝皂苷Rb1测定不全面，关于皂苷Rb1的含量研究较少。因此，本课题选择以绞股蓝皂苷Rb1为研究对象，主要内容有1超技术进行绞股蓝总皂苷的提取；2验采用高效液相色谱法(HPLC)对绞股蓝皂苷Rb1进行了含量测定，并开展线性关系分析、精密度、稳定性、重现性及加样回收试验等，即通过HPLC法对绞股蓝皂苷Rb1含量测定做出定量研究；3对不同地区的绞股蓝皂苷Rb1含量进行实际测定，比较。采用HPLC法技术建立了绞股蓝主要有效成分绞股蓝皂苷Rb1的含量测定方法。方法学考察表明所建立的含量测定方法操作简单、结果准确。通过对不同地区的绞股蓝皂苷Rb1进行实际含量测定，进一步验证了方法的合理性和可行性，同时为以后绞股蓝制剂方面的研究奠定基础。
目 录
1文献综述 1
1.1 绞股蓝的研究现状 1
1.1.1 绞股蓝简介 1
1.1.2 地理分布 1
1.1.3 形态特征 1
1.1.4 资源利用 1
1.2 绞股蓝的药理作用 2
1.2.1 抗肿瘤 2
1.2.2 保护心血管系统 2
1.2.3 保护肝脏 2
1.2.4 抗氧化、抗衰老 3
1.2.5 增强机体免疫力 3
1.2.6 降血脂、降血糖 3
1.3 绞股蓝中的活性成分 4
1.3.1 皂苷类 4
1.3.2 黄酮类 5
1.3.3 甾醇类 5
1.3.4 多糖 5
1.3.5 氨基酸 6
1.3.6 其它成分 6
1.4 研究现状 6
1.4.1 比色法 6
1.4.2 薄层色谱法 ( TLC ) 6
1.4.3 紫外分光光度法 7
1.4.4 HPLC法 7
1.5 绞股蓝研究的意义与主要内容 7
1.5.1 研究的目的及意义 7
1.5.2研究的主要 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
内容 8
2.实验部分 9
2.1 材料、仪器与试剂 9
2.2 实验内容 9
2.2.1 皂苷的提取 9
2.2.2 溶液的制备 10
2.2.3 HPLC确定进样条件 11
2.2.4 标准曲线绘制 11
2.3 实验结果与分析 11
2.3.1 仪器条件的选择 11
2.3.2 标准曲线绘制 12
2.3.3 方法学建立 13
结 论 17
参考文献 18
致 谢 20
1文献综述
1.1 绞股蓝的研究现状
1.1.1 绞股蓝简介
绞股蓝( Gynostemma pentaphyllum)别名七叶胆、小苦药、公罗锅底、遍地生根等，归葫芦科绞股蓝属藤本植物[1]。全世界上有16种2变种，隶属于2亚属2组，即缘果藤亚属和绞股蓝亚属，我国产2亚属2组14种2变种，其中9种2变种为中国特有。绞股蓝是很多医药学家眼中的神仙草，它以全草入药，味苦、性凉、归肺、脾、肾经。具有消炎解毒、止咳祛痰、强壮身体、健脾安神之功效[2]。临床用于治疗老年性疾病，如高血压、高血脂、保护心血管等，因此，获得“第二人参”的美誉。
1.1.2 地理分布
绞股蓝种类多，地域分布也比较广泛，在印度、尼泊尔、锡金、孟加拉、朝鲜、日本的九州及北海道亦有生长，我国主要分布在云南、湖南、广西、广东等，越是靠近北回归线越适合绞股蓝生长，其药用价值也越高。湖北神农架、广西大瑶山、陕西平利被称为我国绞股蓝三大产地，只是三大产地所生产的绞股蓝品种是不同的。其中湖北神农架、广西大瑶山所生产的绞股蓝主要为野生绞股蓝，药用价值比较高；而平利为我国绞股蓝种植基地，品种多，受市场欢迎。
1.1.3 形态特征
绞股蓝为灰棕色或暗棕色，表面皱缩、茎纤细、具纵沟纹，被稀疏绒毛，具有复叶。小叶膜质，常为57枚，少数为9枚，叶柄长24cm，被糙毛；侧生小叶卵状长圆形或长圆状披针形，中央一枚较大，长412cm，宽11.3cm，先端渐尖，基部楔形，两面被粗毛，叶缘有锯齿，齿尖具芒。果实圆球形，直径约5mm，果梗长35mm。味苦，有草腥气。
1.1.4 资源利用
目前，国外特别是日本对绞股蓝的资源利用比较活跃，研制的含绞股蓝成分的片、针剂、胶囊、散剂等用于临床效果良好，制成的食品饮料也深受消费者的喜爱。我国主要常见的是绞股蓝茶，接着是绞股蓝王浆，绞股蓝养生酒等系列产品的推出，这些产品的主要有效成分一般为绞股蓝皂苷，对于绞股蓝中其他成分(如黄酮、多糖、微量元素等）的产品的开发利用还有待发展[3]。
1.2 绞股蓝的药理作用
1.2.1 抗肿瘤
大量的实验证明绞股蓝在体内外有明显的抗肿瘤作用，其直接的细胞毒作用可抑制肿瘤细胞生长繁殖。杨丽霞等人通过采用四氮唑蓝(MTT)比色法检测绞股蓝总皂苷对PC12细胞增殖活力的影响，并用低糖低血清、谷氨、β淀粉样蛋白（Aβ2535）诱导PC12细胞制备细胞损伤模型，观察绞股蓝皂苷低（50μgml1）、中（200μgml1）、高（500μgml1）剂量在3种细胞损伤模型中对细胞存活率和胞浆中乳酸脱氢酶（LDH）释放量的影响。结果表明，绞股蓝总皂苷对正常PC12细胞的存活率有明显的提高，并能有效对抗低糖低血清、谷氨酸、β淀粉样蛋白引起的细胞凋亡，大大降低胞浆中乳酸脱氢酶（LDH）的释放量。刘侠[4]等人对Lewis肺癌荷瘤小鼠进行绞股蓝皂苷给药，结果发现其脾淋巴细胞数目与外周血及脾自然杀伤(NK)细胞均明显升高,说明皂苷的抗肿瘤作用与其能增强机体的免疫功能有关。此外，绞股蓝总皂苷对培养的小鼠艾氏腹水（EAC）、He La细胞均有直接杀灭作用，提取物对人胃癌、宫颈癌、舌癌等培养癌细胞也有明显的杀灭作用。
1.2.2 保护心血管系统
动物实验显示，绞股蓝皂苷对心脑血管系统具有明显的保护作用。它是通过抑制心脑Na+，K+ATP酶的活性从而发挥强心、中枢抑制作用。绞股蓝皂苷还能够抵抗自由基的合成，减小对心脏的损伤，从而保护了心肌细胞膜完整性，改善急性心肌缺血时心肌舒张等。据实验研究显示:昆明种小鼠[5]腹腔内给予注射绞股蓝皂苷后,小鼠耳廓血管、脑膜血管的血流速度及流量出现明显的增加,在微循环微镜下明显可见小动脉血管交通支开放数增多,证明绞股蓝能够增加组织血流量、能够加快血流速度、能够增加脑动脉侧支循环,对缺血性脑损伤可呈现较好的防治作用。
1.2.3 保护肝脏
绞股蓝在肝脏疾病中的应用也得到了广泛的推广。袁国华[6]等人的实验研究表明绞股蓝总皂苷通过上调促凋亡蛋白Bax表达和下调抑凋亡蛋白Bcl2的表达使人肝细胞瘤细胞(Huh7)凋亡，也改变了线粒体膜的通透性导致细胞色素C的释放或其他凋亡因子得到诱导，从而引起的级联活化和诱导细胞凋亡。孙氏[7]等对绞股蓝胶囊和甘利欣胶囊在治疗脂肪肝临床疗效上做了研究,对血脂及转氨酶进行比较，两种药物同时使用后，发现绞股蓝组降血脂作用显著，而转氨酶无明显变化；甘利欣组转氨酶显著下降，血脂无明显变化。绞股蓝组联合甘利欣组降脂降酶作用显著(P<0.01)，表明两者联合应用是治疗脂肪性肝炎的有效手段。
目 录
1文献综述 1
1.1 绞股蓝的研究现状 1
1.1.1 绞股蓝简介 1
1.1.2 地理分布 1
1.1.3 形态特征 1
1.1.4 资源利用 1
1.2 绞股蓝的药理作用 2
1.2.1 抗肿瘤 2
1.2.2 保护心血管系统 2
1.2.3 保护肝脏 2
1.2.4 抗氧化、抗衰老 3
1.2.5 增强机体免疫力 3
1.2.6 降血脂、降血糖 3
1.3 绞股蓝中的活性成分 4
1.3.1 皂苷类 4
1.3.2 黄酮类 5
1.3.3 甾醇类 5
1.3.4 多糖 5
1.3.5 氨基酸 6
1.3.6 其它成分 6
1.4 研究现状 6
1.4.1 比色法 6
1.4.2 薄层色谱法 ( TLC ) 6
1.4.3 紫外分光光度法 7
1.4.4 HPLC法 7
1.5 绞股蓝研究的意义与主要内容 7
1.5.1 研究的目的及意义 7
1.5.2研究的主要 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
内容 8
2.实验部分 9
2.1 材料、仪器与试剂 9
2.2 实验内容 9
2.2.1 皂苷的提取 9
2.2.2 溶液的制备 10
2.2.3 HPLC确定进样条件 11
2.2.4 标准曲线绘制 11
2.3 实验结果与分析 11
2.3.1 仪器条件的选择 11
2.3.2 标准曲线绘制 12
2.3.3 方法学建立 13
结 论 17
参考文献 18
致 谢 20
1文献综述
1.1 绞股蓝的研究现状
1.1.1 绞股蓝简介
绞股蓝( Gynostemma pentaphyllum)别名七叶胆、小苦药、公罗锅底、遍地生根等，归葫芦科绞股蓝属藤本植物[1]。全世界上有16种2变种，隶属于2亚属2组，即缘果藤亚属和绞股蓝亚属，我国产2亚属2组14种2变种，其中9种2变种为中国特有。绞股蓝是很多医药学家眼中的神仙草，它以全草入药，味苦、性凉、归肺、脾、肾经。具有消炎解毒、止咳祛痰、强壮身体、健脾安神之功效[2]。临床用于治疗老年性疾病，如高血压、高血脂、保护心血管等，因此，获得“第二人参”的美誉。
1.1.2 地理分布
绞股蓝种类多，地域分布也比较广泛，在印度、尼泊尔、锡金、孟加拉、朝鲜、日本的九州及北海道亦有生长，我国主要分布在云南、湖南、广西、广东等，越是靠近北回归线越适合绞股蓝生长，其药用价值也越高。湖北神农架、广西大瑶山、陕西平利被称为我国绞股蓝三大产地，只是三大产地所生产的绞股蓝品种是不同的。其中湖北神农架、广西大瑶山所生产的绞股蓝主要为野生绞股蓝，药用价值比较高；而平利为我国绞股蓝种植基地，品种多，受市场欢迎。
1.1.3 形态特征
绞股蓝为灰棕色或暗棕色，表面皱缩、茎纤细、具纵沟纹，被稀疏绒毛，具有复叶。小叶膜质，常为57枚，少数为9枚，叶柄长24cm，被糙毛；侧生小叶卵状长圆形或长圆状披针形，中央一枚较大，长412cm，宽11.3cm，先端渐尖，基部楔形，两面被粗毛，叶缘有锯齿，齿尖具芒。果实圆球形，直径约5mm，果梗长35mm。味苦，有草腥气。
1.1.4 资源利用
目前，国外特别是日本对绞股蓝的资源利用比较活跃，研制的含绞股蓝成分的片、针剂、胶囊、散剂等用于临床效果良好，制成的食品饮料也深受消费者的喜爱。我国主要常见的是绞股蓝茶，接着是绞股蓝王浆，绞股蓝养生酒等系列产品的推出，这些产品的主要有效成分一般为绞股蓝皂苷，对于绞股蓝中其他成分(如黄酮、多糖、微量元素等）的产品的开发利用还有待发展[3]。
1.2 绞股蓝的药理作用
1.2.1 抗肿瘤
大量的实验证明绞股蓝在体内外有明显的抗肿瘤作用，其直接的细胞毒作用可抑制肿瘤细胞生长繁殖。杨丽霞等人通过采用四氮唑蓝(MTT)比色法检测绞股蓝总皂苷对PC12细胞增殖活力的影响，并用低糖低血清、谷氨、β淀粉样蛋白（Aβ2535）诱导PC12细胞制备细胞损伤模型，观察绞股蓝皂苷低（50μgml1）、中（200μgml1）、高（500μgml1）剂量在3种细胞损伤模型中对细胞存活率和胞浆中乳酸脱氢酶（LDH）释放量的影响。结果表明，绞股蓝总皂苷对正常PC12细胞的存活率有明显的提高，并能有效对抗低糖低血清、谷氨酸、β淀粉样蛋白引起的细胞凋亡，大大降低胞浆中乳酸脱氢酶（LDH）的释放量。刘侠[4]等人对Lewis肺癌荷瘤小鼠进行绞股蓝皂苷给药，结果发现其脾淋巴细胞数目与外周血及脾自然杀伤(NK)细胞均明显升高,说明皂苷的抗肿瘤作用与其能增强机体的免疫功能有关。此外，绞股蓝总皂苷对培养的小鼠艾氏腹水（EAC）、He La细胞均有直接杀灭作用，提取物对人胃癌、宫颈癌、舌癌等培养癌细胞也有明显的杀灭作用。
1.2.2 保护心血管系统
动物实验显示，绞股蓝皂苷对心脑血管系统具有明显的保护作用。它是通过抑制心脑Na+，K+ATP酶的活性从而发挥强心、中枢抑制作用。绞股蓝皂苷还能够抵抗自由基的合成，减小对心脏的损伤，从而保护了心肌细胞膜完整性，改善急性心肌缺血时心肌舒张等。据实验研究显示:昆明种小鼠[5]腹腔内给予注射绞股蓝皂苷后,小鼠耳廓血管、脑膜血管的血流速度及流量出现明显的增加,在微循环微镜下明显可见小动脉血管交通支开放数增多,证明绞股蓝能够增加组织血流量、能够加快血流速度、能够增加脑动脉侧支循环,对缺血性脑损伤可呈现较好的防治作用。
1.2.3 保护肝脏
绞股蓝在肝脏疾病中的应用也得到了广泛的推广。袁国华[6]等人的实验研究表明绞股蓝总皂苷通过上调促凋亡蛋白Bax表达和下调抑凋亡蛋白Bcl2的表达使人肝细胞瘤细胞(Huh7)凋亡，也改变了线粒体膜的通透性导致细胞色素C的释放或其他凋亡因子得到诱导，从而引起的级联活化和诱导细胞凋亡。孙氏[7]等对绞股蓝胶囊和甘利欣胶囊在治疗脂肪肝临床疗效上做了研究,对血脂及转氨酶进行比较，两种药物同时使用后，发现绞股蓝组降血脂作用显著，而转氨酶无明显变化；甘利欣组转氨酶显著下降，血脂无明显变化。绞股蓝组联合甘利欣组降脂降酶作用显著(P<0.01)，表明两者联合应用是治疗脂肪性肝炎的有效手段。
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