星点设计法优化湿法超微粉碎地龙蛋白的提取工艺
摘 要本文选用星点设计效应面法对湿法超威粉碎地龙蛋白的提取工艺进行优化，通过考马斯亮蓝法对地龙蛋白质的有效成分进行含量测定，研究实验过程中浸泡时间、料液比、提取温度、粉碎时间对地龙蛋白得率的影响。应用在单因素实验基础上，以浸泡时间、料液比、提取温度、粉碎时间为影响因素，蛋白质得率为响应值。采用四因素、三水平的响应面分析法，对湿法超微粉碎提取地龙蛋白的工艺进行优化。此方法得出提取地龙蛋白的最佳工艺条件为浸泡时间为4.7h，料液比为1:11，提取温度为17℃，粉碎时间为10min。在此实验条件下蛋白质得率为3.46%。所以地龙蛋白适合采用湿法超微粉碎提取，也可适用于工业化生产。目 录
1 文献研究
1.1 研究背景 1
1.1.1 文献记载 1
1.1.2 生长环境 1
1.1.3 地理分布 2
1.1.4 采收和储藏 2
1.1.5 地龙的化学成分 2
1.2 药用价值 3
1.2.1 炮制方法 3
1.2.2 地龙的现代应用 4
1.2.2.1 炮制作用 4
1.2.2.2 地龙的临床应用 4
1.2.2.3 用药宜忌 5
2 实验研究
2.1 湿法超威粉碎机的原理及特点 6
2.2 材料与仪器 6
2.3 方法与结果 6
2.3.1 蛋白质含量测定 6
2.3.2 蛋白质得率 7
2.4 单因素实验 7
2.4.1 浸泡时间对地龙蛋白质得率的影响 7
2.4.2 料液比对地龙蛋白质得率的影响 8
2.4.3 提取温度对地龙蛋白质得率的影响 8
2.4.4 粉碎时间对地龙蛋白质得率的影响 9
2.5 星点设计效应面分析法优化工艺 9
2.5.1星点设计效应面法的基本原理 9
2.5.2中心组合实验设计 9
2.5.3 回归模型的方差分析 11
2.5.4 星点设计响应面工艺优化分析 12
结论与讨论 15
参考文献 16
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
br /> 2.4.4 粉碎时间对地龙蛋白质得率的影响 9
2.5 星点设计效应面分析法优化工艺 9
2.5.1星点设计效应面法的基本原理 9
2.5.2中心组合实验设计 9
2.5.3 回归模型的方差分析 11
2.5.4 星点设计响应面工艺优化分析 12
结论与讨论 15
参考文献 16
致谢 17
1 文献研究
1.1 研究背景
蚯蚓在地球上大约存活了2.5亿年，蚯蚓是对环节动物门寡毛纲类动物的通称。在科学分类中它们属于单向蚓目，身体两侧对称，具有分节现象；没有骨骼，在体表覆盖一层具有色素的薄角质层，蛋白质含量达70%，还有微量元素如：磷、钙、铁、钾、锌、铜以及多种维生素。除了身体前两节之外，其余各节均具有刚毛。雌雄同体，异体受精，生殖时借由环带产生卵茧。地龙提取液对人体血液抗凝有很好的治疗作用，它可以使人体血液的凝血、凝血酶及凝血酶原的时间均显著延长，并呈现出很好的量效关系[12]；同时可以使血液黏度降低并防止血栓形成．它的抗凝机制是：它可以对凝血酶纤维蛋白原反应起到抑制作用．与此同时地龙还具有一定的促纤溶作用， 可以让已经凝结的血栓溶解。所以地龙的研究对社会的发展起到了重要作用[3]。
1.1.1 文献记载
“地龙”一名最早出现在宋代《圣惠方》中。“蚯蚓”载于《神农本草经》，列为下品。李时珍谓：“今处处平泽膏囊中有之，孟夏始出，仲冬蛰结，雨则先出。”陶弘景谓：“入药用白颈，是其老者。”从现代分类学看，白颈是指似戒指状的生殖环带，呈乳白色或肉红色，在性成熟才显现出来，是东方分布最多的环毛蚓属最显著的标志，古本草中收载的“白颈蚯蚓”应是环毛蚓属动物，所述“颈白身紫”、“入药宜大”的描述应为现代的“广地龙”药材。
在古代，对于地龙的炮制就有了许多方法，如宋代有炙干为末、熬制、煅炭（《证类》）、微炒（《圣惠方》）、醋制（《总录》）等方法。元代增加了酒浸、油炙（《世医》）、酒炒（《丹溪》）的方法，明、清以后又增加了蛤粉炒（《普济方》）、盐炙（《蒙》）、炭炒（《释谜》）等法。现在主要的炮制方法有酒炙、醋炙等。
1.1.2 生长环境
地龙喜欢生活在温暖潮湿的环境，一般温度在20℃25℃为最佳温度，土壤湿度一般在40%60%，空气湿度在60%80%，蚯蚓因为喜阴怕光所以一般生活在地下。通常在地下或是基料中觅食。蚯蚓排出的粪便中含有丰富的氮、磷、钾、镁等矿物质元素以及铜、硼、锰等微量元素，不仅是农作物的好养料，而且使土壤的肥力大大增加，促进植物的生长。
1.1.3 地理分布
在我国，地龙的品种多达9科28属306种，一般中药材所指地龙为广地龙和土地龙，其中广地龙的主产于广东南海、茂名、阳江、灵山、龙门、高要、韶关、佛山、平远、钦县，广西容县、梧州、北流等近河边地方，以广东产品最优，销售全国和出口。土地龙：主产于河南郑州，中牟，山东东平、微山、梁山，安徽蚌埠、安庆，福建宁化。此外内蒙古、新疆、青海、甘肃、陕西、湖北等地均产,一般均自产自销。
1.1.4 采收和储藏
蚯蚓生活在潮湿、疏松、富含有机物的土壤中。白天以泥土中的有机物为食，夜间爬出地面，取食地面上的落叶。采集蚯蚓的时间，一年之中以春末夏初最好，此时蚯蚓数量较多，活动旺盛；一天之中以早晨最好，此时气温适中，光照较弱，近地面空气温度较大，蚯蚓大多集中在上层土壤中活动。采集蚯蚓的方法多种多样，常用的有以下几种。
挖掘法：选择腐殖质丰富、土壤肥沃、湿润、疏松的地方，如菜园，用铁铲翻土采集。
灌水法：蚯蚓数量较多的田地灌水，蚯蚓很快从土内钻出来。
拾取法：蚯蚓喜栖黑暗环境，在春末，每逢晚上下雨，可在凌晨34点钟时，到田边手持电筒拾取。
诱捕法：蚯蚓喜食新鲜饲料，我们将发酵的饲料堆在蚯蚓较多的田边，35天后，即可用铁铲翻开采集。
将处理好的地龙放于通风有盖、干净的木箱或铁箱中,盖紧存放在干燥、通风的地方。此后,还应经常检查,特别是春夏季节,是霉菌和虫害发生最历害的季节,应每周检查一次。如发现霉变或虫蛀应立即放在烈日下曝晒,晒后用铁筛筛过,把霉粉、成虫或虫卵筛去,再放在上述的容器内贮藏
1.1.5 地龙的化学成分
地龙中含有溶栓酶、过氧化氢酶、βD葡萄糖苷酶、酶脂和其他酶类，地龙中富含多种蛋白质及多肽，如脂类蛋白、钙
1 文献研究
1.1 研究背景 1
1.1.1 文献记载 1
1.1.2 生长环境 1
1.1.3 地理分布 2
1.1.4 采收和储藏 2
1.1.5 地龙的化学成分 2
1.2 药用价值 3
1.2.1 炮制方法 3
1.2.2 地龙的现代应用 4
1.2.2.1 炮制作用 4
1.2.2.2 地龙的临床应用 4
1.2.2.3 用药宜忌 5
2 实验研究
2.1 湿法超威粉碎机的原理及特点 6
2.2 材料与仪器 6
2.3 方法与结果 6
2.3.1 蛋白质含量测定 6
2.3.2 蛋白质得率 7
2.4 单因素实验 7
2.4.1 浸泡时间对地龙蛋白质得率的影响 7
2.4.2 料液比对地龙蛋白质得率的影响 8
2.4.3 提取温度对地龙蛋白质得率的影响 8
2.4.4 粉碎时间对地龙蛋白质得率的影响 9
2.5 星点设计效应面分析法优化工艺 9
2.5.1星点设计效应面法的基本原理 9
2.5.2中心组合实验设计 9
2.5.3 回归模型的方差分析 11
2.5.4 星点设计响应面工艺优化分析 12
结论与讨论 15
参考文献 16
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
br /> 2.4.4 粉碎时间对地龙蛋白质得率的影响 9
2.5 星点设计效应面分析法优化工艺 9
2.5.1星点设计效应面法的基本原理 9
2.5.2中心组合实验设计 9
2.5.3 回归模型的方差分析 11
2.5.4 星点设计响应面工艺优化分析 12
结论与讨论 15
参考文献 16
致谢 17
1 文献研究
1.1 研究背景
蚯蚓在地球上大约存活了2.5亿年，蚯蚓是对环节动物门寡毛纲类动物的通称。在科学分类中它们属于单向蚓目，身体两侧对称，具有分节现象；没有骨骼，在体表覆盖一层具有色素的薄角质层，蛋白质含量达70%，还有微量元素如：磷、钙、铁、钾、锌、铜以及多种维生素。除了身体前两节之外，其余各节均具有刚毛。雌雄同体，异体受精，生殖时借由环带产生卵茧。地龙提取液对人体血液抗凝有很好的治疗作用，它可以使人体血液的凝血、凝血酶及凝血酶原的时间均显著延长，并呈现出很好的量效关系[12]；同时可以使血液黏度降低并防止血栓形成．它的抗凝机制是：它可以对凝血酶纤维蛋白原反应起到抑制作用．与此同时地龙还具有一定的促纤溶作用， 可以让已经凝结的血栓溶解。所以地龙的研究对社会的发展起到了重要作用[3]。
1.1.1 文献记载
“地龙”一名最早出现在宋代《圣惠方》中。“蚯蚓”载于《神农本草经》，列为下品。李时珍谓：“今处处平泽膏囊中有之，孟夏始出，仲冬蛰结，雨则先出。”陶弘景谓：“入药用白颈，是其老者。”从现代分类学看，白颈是指似戒指状的生殖环带，呈乳白色或肉红色，在性成熟才显现出来，是东方分布最多的环毛蚓属最显著的标志，古本草中收载的“白颈蚯蚓”应是环毛蚓属动物，所述“颈白身紫”、“入药宜大”的描述应为现代的“广地龙”药材。
在古代，对于地龙的炮制就有了许多方法，如宋代有炙干为末、熬制、煅炭（《证类》）、微炒（《圣惠方》）、醋制（《总录》）等方法。元代增加了酒浸、油炙（《世医》）、酒炒（《丹溪》）的方法，明、清以后又增加了蛤粉炒（《普济方》）、盐炙（《蒙》）、炭炒（《释谜》）等法。现在主要的炮制方法有酒炙、醋炙等。
1.1.2 生长环境
地龙喜欢生活在温暖潮湿的环境，一般温度在20℃25℃为最佳温度，土壤湿度一般在40%60%，空气湿度在60%80%，蚯蚓因为喜阴怕光所以一般生活在地下。通常在地下或是基料中觅食。蚯蚓排出的粪便中含有丰富的氮、磷、钾、镁等矿物质元素以及铜、硼、锰等微量元素，不仅是农作物的好养料，而且使土壤的肥力大大增加，促进植物的生长。
1.1.3 地理分布
在我国，地龙的品种多达9科28属306种，一般中药材所指地龙为广地龙和土地龙，其中广地龙的主产于广东南海、茂名、阳江、灵山、龙门、高要、韶关、佛山、平远、钦县，广西容县、梧州、北流等近河边地方，以广东产品最优，销售全国和出口。土地龙：主产于河南郑州，中牟，山东东平、微山、梁山，安徽蚌埠、安庆，福建宁化。此外内蒙古、新疆、青海、甘肃、陕西、湖北等地均产,一般均自产自销。
1.1.4 采收和储藏
蚯蚓生活在潮湿、疏松、富含有机物的土壤中。白天以泥土中的有机物为食，夜间爬出地面，取食地面上的落叶。采集蚯蚓的时间，一年之中以春末夏初最好，此时蚯蚓数量较多，活动旺盛；一天之中以早晨最好，此时气温适中，光照较弱，近地面空气温度较大，蚯蚓大多集中在上层土壤中活动。采集蚯蚓的方法多种多样，常用的有以下几种。
挖掘法：选择腐殖质丰富、土壤肥沃、湿润、疏松的地方，如菜园，用铁铲翻土采集。
灌水法：蚯蚓数量较多的田地灌水，蚯蚓很快从土内钻出来。
拾取法：蚯蚓喜栖黑暗环境，在春末，每逢晚上下雨，可在凌晨34点钟时，到田边手持电筒拾取。
诱捕法：蚯蚓喜食新鲜饲料，我们将发酵的饲料堆在蚯蚓较多的田边，35天后，即可用铁铲翻开采集。
将处理好的地龙放于通风有盖、干净的木箱或铁箱中,盖紧存放在干燥、通风的地方。此后,还应经常检查,特别是春夏季节,是霉菌和虫害发生最历害的季节,应每周检查一次。如发现霉变或虫蛀应立即放在烈日下曝晒,晒后用铁筛筛过,把霉粉、成虫或虫卵筛去,再放在上述的容器内贮藏
1.1.5 地龙的化学成分
地龙中含有溶栓酶、过氧化氢酶、βD葡萄糖苷酶、酶脂和其他酶类，地龙中富含多种蛋白质及多肽，如脂类蛋白、钙
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