异育银鲫mstn基因克隆及生长相关的多态性位点的筛选
1本文采用分子克隆技术得到了异育银鲫“中科三号”和MSTN基因的DNA序列全长和自繁异育银鲫MSTN基因部分序列。并通过半定量RT-PCR方法检测了MSTN基因mRNA在银鲫银鲫鳃、心、肠、肝、脑和肌肉6个组织中的表达情况，表达水平依次为脑 >肌≈鳃>心>肠>肝。由MSTN在异育银鲫中的表达特征和表达水平分析，异育银鲫MSTN基因除调控肌肉生长发育外，还有可能参与心肌发育调控和代谢等其他功能。采用直接测序法通过比对分析后在中科三号外显子2、外显子3以及自繁异育银鲫外显子2上分别筛选到一个多态性位点。以生长对比实验中中科三号及自繁异育银鲫为研究对象，用Snapshot技术对3个多态性位点进行基因分型。再对两种异育银鲫的生长性状和基因型进行相关性分析。检测到中科三号品种MSTN基因外显子2和外显子3上两个多态性位点产生的两种基因型与体重及体长呈显著相关，GT基因型个体比TT基因型个体体重增加了14.4%；而自繁异育银鲫MSTN基因外显子2上多态性位点形成的两种基因型与生长性状无显著相关。结果为中科三号的分子育种奠定一定基础，但因此突变只形成两种基因型，有可能为假突变，需要进一步加大样本量进行实验来验证。
目录
引言
MSTN 全称肌生成抑制素(Myostatin) ,又称为生长/分化因子8(GDF8), 是1997年美国John Hopkins 大学医学院的一个研究小组在研究转化生长因子β(TGFβ)时发现的一种新的生长因子，该因子具有TGFβ共有的结构特征。MSTN基因首先从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆出，McPherron 研究发现该基因缺失鼠肌肉增大, 骨骼肌肌群分布更广泛, 体重约是野生鼠2 倍[1]。在哺乳动物中,MSTN 主要在骨骼肌中表达, 并且在生长时期和成熟期的骨骼肌中均有表达。MSTN 在发育的牛和啮齿类骨骼肌中含量高, 后来Sharma[2]等采用比以往更灵敏的测定技术检测到在其他组织器官中也有MSTN 的分布。鸡的MSTN 基因除在骨骼肌中表达外, 在心肌、肠、脾脏、脑中也有少量表达。[3]
由于MSTN在遗传育种上的潜在应用价值, 自其被发现以来,一直备受科研工作者的广泛关注,已克隆得到多种鱼类的MSTN 基因, 如斑马鱼[4]、虹鳟[5]、大口黑鲈[6]、眼斑拟石首鱼[7]、大黄鱼[ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
8]、加州鲈[9]、鲤鱼[10]、日本牙鲆[11]、斑点叉尾鮰[12]。鱼类MSTN可在骨骼肌表达以外, 还可在目前报道的鱼类多个组织如肝、心、胃、鳃、卵巢、精巢、肾、肌肉、眼和脑等中表达[13]。MSTN作为肌肉生长发育相关的重要调控基因，对其研究对了解鱼类肌肉生长机理有重要作用。本实验克隆了自繁异育银鲫和中科三号的MSTN基因，并对其序列和组织表达进行了分析和比较。
SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性标记, 又称单核昔酸多态性, 是广泛存在于基因组中的一类由单个碱基转换或颠换引起的DNA 序列多态性，是普遍存在于生物基因组中的一种新型分子标记[14]。本研究在通过采用Snapshot方法对2种异育银鲫MSTN基因的三个多态性位点进行分型，将之与相关生长性状进行关联分析，找到有效的分子标记选育方案，将多态性位点更广泛的运用到鲫鱼分子标记辅助育种中。
1.材料与方法
1.1实验材料
实验用自繁异育银鲫重量60g左右、中科三号重量80g左右，购自扬州江都，分别取20条于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心（无锡）育种实验室进行暂养用以RNA及DNA的提取，其余用PIT标记进行体重、体长、体高、体宽4项生长指标等指标测量后于淡水渔业研究中心南泉养殖基地（无锡）进行对比养殖。RNAiso plus试剂盒， Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒，PrimeScriptTM1Sst strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，3’Full RACE Core Set with PrimecriptTM RTase试剂盒，5’Full RACE Kit试剂盒，TAKARA MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒，TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0试剂盒，DH5α和Pmd 18T Vector等试剂均购自TAKARA公司（大连）。Taq酶、dNTP、ExoI、FastAP均购自Fermentas公司，单碱基延伸试剂盒为ABI公司的 SNaPshot Multiples Kit。实验中用到的测序仪为ABI公司的 3730XL DNA Analyzer，PCR仪为EDC810，Thermal Cycler。
1.2实验方法
1.2.1总RNA的提取
取2种实验鱼骨骼肌、脑、肝、肠、心、鳃六个组织，按TAKARA公司RNAiso plus的方法提取总RNA，RNA于80℃下保存，并用1%琼脂糖电泳和分光光度计检测其质量和浓度。
1.2.2基因组DNA 提取及各组织cDNA 制备
使用TAKARA公司Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒，使用匀浆和细胞裂解的方法从加入柠檬酸钠的2种实验鱼全血中提取基因组DNA，并用1%琼脂糖电泳和分光光度计检测其质量和浓度。
按反转录试剂盒（PrimeScriptTM1Sst strand cDNA Synthesis Kit）要求进行反转录反应，反应体系：1μL Random 6 mers(50μM)，1μL dNTP Mixture(10 mM each)，Template RNA （根据提取RNA的浓度，用于作为中间片段模板的加入total RNA 5μg，用于作为半定量RTPCR模板的加入total RNA 1 μg），加入RNase free dH2O 至10 μL。65℃处理5分钟后冰上迅速冷却。再在体系中加入4μL 5×PrimeScript Buffer，0.5μL RNase Inhibitor(40 U/μL)，1μL PrimeScript RTase(200 U/μL)，加入RNase free dH2O 至20 μL，缓慢混匀，反应条件：30℃×10 min，42℃×60 min，95℃×5 min，置于20℃保存。得到cDNA模板。
根据GenBank登录的鲤鱼（Cyprinus carpio ，GQ214770.1）和斑马鱼（Danio rerio，AY323521.1）的MSTN基因设计三对引物MSTNF1，MSTNR1，MSTNF2，MSTNR2，MSTNF3、MSTNR3（表1）和MSTNf1，MSTNr1，MSTNf2，MSTNr2，MSTNf3、MSTNr3（表2），用于扩增MSTN cDNA核心片段。以2种实验鱼骨骼肌cDNA为模板用以下体系反应：TAKARA Taq(5U/μl) 0.125 μL，10×PCR Buffer(Mg2+ Plus) 1.25μL，dNTP Mixture(2.5 mM each) 1μL，MSTNF1 0.25μL，MSTNR1 0.25μL，模板DNA0.5μL，加入RNase free dH2O 至12.5 μL。反应条件：94℃预变性4min，94℃×30 s，56/57℃×45s，72℃×1min，共30个循坏；72℃延伸8min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳检测，用TAKARA MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒胶回收目的片段，回收液在16℃与 pMD18T载体连接过夜后转化到DH5α感受态细胞中在LB Amp+平板上37℃培养过夜，挑选白色菌落于LB Amp+液体培养基中扩大培养，使用质粒抽提试剂盒TAKARA MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0抽提质粒，然后进行EcoR I和Hind III酶切验证，将阳性克隆送出测序（上海铂尚生物技术有限公司），每个平板至少送3个。
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MSTN 全称肌生成抑制素(Myostatin) ,又称为生长/分化因子8(GDF8), 是1997年美国John Hopkins 大学医学院的一个研究小组在研究转化生长因子β(TGFβ)时发现的一种新的生长因子，该因子具有TGFβ共有的结构特征。MSTN基因首先从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆出，McPherron 研究发现该基因缺失鼠肌肉增大, 骨骼肌肌群分布更广泛, 体重约是野生鼠2 倍[1]。在哺乳动物中,MSTN 主要在骨骼肌中表达, 并且在生长时期和成熟期的骨骼肌中均有表达。MSTN 在发育的牛和啮齿类骨骼肌中含量高, 后来Sharma[2]等采用比以往更灵敏的测定技术检测到在其他组织器官中也有MSTN 的分布。鸡的MSTN 基因除在骨骼肌中表达外, 在心肌、肠、脾脏、脑中也有少量表达。[3]
由于MSTN在遗传育种上的潜在应用价值, 自其被发现以来,一直备受科研工作者的广泛关注,已克隆得到多种鱼类的MSTN 基因, 如斑马鱼[4]、虹鳟[5]、大口黑鲈[6]、眼斑拟石首鱼[7]、大黄鱼[ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
8]、加州鲈[9]、鲤鱼[10]、日本牙鲆[11]、斑点叉尾鮰[12]。鱼类MSTN可在骨骼肌表达以外, 还可在目前报道的鱼类多个组织如肝、心、胃、鳃、卵巢、精巢、肾、肌肉、眼和脑等中表达[13]。MSTN作为肌肉生长发育相关的重要调控基因，对其研究对了解鱼类肌肉生长机理有重要作用。本实验克隆了自繁异育银鲫和中科三号的MSTN基因，并对其序列和组织表达进行了分析和比较。
SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性标记, 又称单核昔酸多态性, 是广泛存在于基因组中的一类由单个碱基转换或颠换引起的DNA 序列多态性，是普遍存在于生物基因组中的一种新型分子标记[14]。本研究在通过采用Snapshot方法对2种异育银鲫MSTN基因的三个多态性位点进行分型，将之与相关生长性状进行关联分析，找到有效的分子标记选育方案，将多态性位点更广泛的运用到鲫鱼分子标记辅助育种中。
1.材料与方法
1.1实验材料
实验用自繁异育银鲫重量60g左右、中科三号重量80g左右，购自扬州江都，分别取20条于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心（无锡）育种实验室进行暂养用以RNA及DNA的提取，其余用PIT标记进行体重、体长、体高、体宽4项生长指标等指标测量后于淡水渔业研究中心南泉养殖基地（无锡）进行对比养殖。RNAiso plus试剂盒， Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒，PrimeScriptTM1Sst strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，3’Full RACE Core Set with PrimecriptTM RTase试剂盒，5’Full RACE Kit试剂盒，TAKARA MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒，TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0试剂盒，DH5α和Pmd 18T Vector等试剂均购自TAKARA公司（大连）。Taq酶、dNTP、ExoI、FastAP均购自Fermentas公司，单碱基延伸试剂盒为ABI公司的 SNaPshot Multiples Kit。实验中用到的测序仪为ABI公司的 3730XL DNA Analyzer，PCR仪为EDC810，Thermal Cycler。
1.2实验方法
1.2.1总RNA的提取
取2种实验鱼骨骼肌、脑、肝、肠、心、鳃六个组织，按TAKARA公司RNAiso plus的方法提取总RNA，RNA于80℃下保存，并用1%琼脂糖电泳和分光光度计检测其质量和浓度。
1.2.2基因组DNA 提取及各组织cDNA 制备
使用TAKARA公司Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒，使用匀浆和细胞裂解的方法从加入柠檬酸钠的2种实验鱼全血中提取基因组DNA，并用1%琼脂糖电泳和分光光度计检测其质量和浓度。
按反转录试剂盒（PrimeScriptTM1Sst strand cDNA Synthesis Kit）要求进行反转录反应，反应体系：1μL Random 6 mers(50μM)，1μL dNTP Mixture(10 mM each)，Template RNA （根据提取RNA的浓度，用于作为中间片段模板的加入total RNA 5μg，用于作为半定量RTPCR模板的加入total RNA 1 μg），加入RNase free dH2O 至10 μL。65℃处理5分钟后冰上迅速冷却。再在体系中加入4μL 5×PrimeScript Buffer，0.5μL RNase Inhibitor(40 U/μL)，1μL PrimeScript RTase(200 U/μL)，加入RNase free dH2O 至20 μL，缓慢混匀，反应条件：30℃×10 min，42℃×60 min，95℃×5 min，置于20℃保存。得到cDNA模板。
根据GenBank登录的鲤鱼（Cyprinus carpio ，GQ214770.1）和斑马鱼（Danio rerio，AY323521.1）的MSTN基因设计三对引物MSTNF1，MSTNR1，MSTNF2，MSTNR2，MSTNF3、MSTNR3（表1）和MSTNf1，MSTNr1，MSTNf2，MSTNr2，MSTNf3、MSTNr3（表2），用于扩增MSTN cDNA核心片段。以2种实验鱼骨骼肌cDNA为模板用以下体系反应：TAKARA Taq(5U/μl) 0.125 μL，10×PCR Buffer(Mg2+ Plus) 1.25μL，dNTP Mixture(2.5 mM each) 1μL，MSTNF1 0.25μL，MSTNR1 0.25μL，模板DNA0.5μL，加入RNase free dH2O 至12.5 μL。反应条件：94℃预变性4min，94℃×30 s，56/57℃×45s，72℃×1min，共30个循坏；72℃延伸8min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳检测，用TAKARA MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒胶回收目的片段，回收液在16℃与 pMD18T载体连接过夜后转化到DH5α感受态细胞中在LB Amp+平板上37℃培养过夜，挑选白色菌落于LB Amp+液体培养基中扩大培养，使用质粒抽提试剂盒TAKARA MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0抽提质粒，然后进行EcoR I和Hind III酶切验证，将阳性克隆送出测序（上海铂尚生物技术有限公司），每个平板至少送3个。
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