利用vigs技术研究棉花光子基因ghn1的功能
: 1Abstract: 1Key words: 1引言 11 材料与方法 21.1.实验材料 21.2实验方法 21.2.1 RNA的提取 31.2.2 总RNA的DNaseI消化 31.2.3 mRNA逆转录反应 31.2.4 定量PCR分析 32.实验结果 42.1 GhN1的组织特异性表达 42.2 GhN1在野生型和突变体之间的表达差异 52.3 用VIGS方法验证GhN1的功能 53 结论 6致谢 7参考文献 7附录 9利用VIGS技术研究棉花光子GhN1基因的功能农学(金善宝实验班) 杨楠楠通过对有短绒材料TM-1胚珠进行实时荧光定量PCR( qRT-PCR)分析GhN1在纤维起始期-1 DPA 到+3 DPA表达量最高，当纤维开始伸长时表达量又迅速下降。同时期，GhN1在无短绒突变体N1中的表达量显著低于TM-1。为此，我们从TM-1中克隆了GhN1的3’端片段(652~931bp)，并转入pTRV2载体中，构建GhN1基因沉默载体，进行基因诱导沉默（VIGS）快速分析GhN1基因功能，结果诱导后植株出现四种表型，其中一种表现为正常纤维，三种表现为短绒显著减少。提取处理后植株的-1 DPA、1 DPA和3 DPA的胚珠的RNA，qRT-PCR发现GhN1的表达量在沉默植株中明显低于对照植株。
目录
引言
棉纤维是重要的天然纤维纺织原料。棉纤维是从棉花胚珠外表皮细胞发育而来的。在纤维的发育过程中，前后会出现2次明显的纤维突起高峰。3 0 DPA突起的表皮细胞最终发育成商业上可利用的长纤维(lint)，而4~5 DPA左右突起的表皮细胞仅仅发育到几mm就停止伸长，称之为短绒(fuzz)的纤维。
突变体作为非常有用的研究材料有助于我们更好的研究和了解重要基因的遗传机理，作用方式及分子调控机制。目前棉花上已报道多个棉纤维突变体材料。如，李氏极短纤维突变体Li1[1]和Li2[2]；无绒有絮突变体，也称为光籽突变体N1(N1NSM)和n2(n2NSM)[3,4]；无绒无絮突变体L40[5], MCU5[6], MD17FLM[7], SL171FLM [8]以及XZ142FLM[9]。
Kohel等报道光子性状主要由两个独立的位点控制，即显性光子基因和隐性光子基因，并分别被命名为N1和n2
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
，同时N1和n2之间存在上位性作用[10]。由N1控制的光子性状比较稳定，而不同的遗传背景和生长环境对n2影响较大。Zhang 和 Pan研究认为，在控制短绒方面，正常有短绒的野生型、显性光子突变体N1和隐性光子突变体n2的基因型分别为n1n1N2N2, N1N1N2N2和n1n1n2n2[9]。Turley和Kloth研究认为还存在第三个基因n3控制光子性状，n3的显性基因N3控制短绒的生长和发育[11]。
宋丽等将N1定位在第 12 染色体上SSR标记NAU4020和BNL1679之间[12]，万群在此基础上将N1定位在更近的位置，锚定基因组后找到显性光子候选基因GhN1[13]，本研究旨在应用病毒介导的基因沉默（Virusinduced gene silencing，VIGS）、实时荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，qRTPCR）等方法来验证该基因的功能。
1 材料与方法
1.1.实验材料
本研究所用材料如下：陆地棉遗传标准系TM1和无绒有絮棉花纤维突变体N1。突变体材料的表型见图1。2014植于大学江浦试验站，4月中旬播种，五月中旬移栽，7月下旬到8月中旬为盛花期，7月31日为取材的基准点。
取材：各研究材料3 DPA，1 DPA，0 DPA，1 DPA，3 DPA，5 DPA，10 DPA，20 DPA，25 DPA胚珠和纤维以及根、茎和叶迅速置于液氮中冷冻并保存在70 ℃冰箱备用。
图1 TM1 和N1突变体的种子表型。棉花种子纤维包括长纤维（可纺织纤维）和压花后短绒如TM1，或无短绒种子如N1。标尺为1cm。
Figure 1 Cotton seeds from TM1 and N1 mutants. The wild cotton seed with fiber including lint (spinnable fiber) and fuzz seed after gins in TM1, and naked seed or fuzzlesslinted seed cotton in N1.Scale bar = 1cm.
1.2 实验方法
1.2.1 RNA的提取
RNA的提取采用改进的CTAB酸酚法[14]，具体步骤如下：1.5 ml离心管中，加5倍体积 RNA提取缓冲液(NaCl 1.4 mol/L，TrisHC l0.1 mol/L，EDTA 20 mmol/L，CTAB 2%，PVP 2%，β巯基乙醇 1%，NaCl溶解后再加入CTAB，配好后加 1% DEPC，高压灭菌)，振荡混匀，封口膜封口，匀浆仪匀浆约1 min，65 ℃水浴约20 min，中途可颠倒混和2～3次，使RNA充分析出；加0.6 倍体积的氯仿，混匀，冰浴20 min，4 ℃，10,000 rpm离心10 min，将上清液转移到另一新1.5 ml离心管中。加1/3倍体积8 mol/L LiCl溶液，混匀，冰浴(20 ℃ 6 h或70 ℃ 1 h左右)；4 ℃，10000 rpm离心20 min，弃去上清液，用70% 乙醇洗涤沉淀1次，并将沉淀转移到1.5 mL Eppendorf管中；10000 rpm离心5 min，弃去乙醇溶液，将沉淀置抽干仪(Universal Vacuum System Plus UVS400A with VaporNet?, Speed Vac? Plus SC110A, Savant)抽干；加88 ul无RNase的ddH2O，10 ul Rnase溶解沉淀，并分成两管，每管加0.6 倍体积的水饱和酚：氯仿 (1：1)，充分混匀，室温静置5 min；4 ℃，12000 rpm离心20 min，将上清液转移到另一新1.5 ml 管中，再加0.6 倍体积的水饱和酚：氯仿 (1：1)重复抽提1次；12000 rpm离心20 min，上清液加0.6倍体积的氯仿抽提 1 次；12000 rpm离心20 min，上清液加1/3倍体积8 mol/L LiCl溶液，冰浴1 h；12000 rpm离心20 min，沉淀用70 %乙醇洗涤沉淀1次，真空抽干后溶于100～200 μl无RNase的ddH2O中，取2 μl电泳和吸光值检测RNA质量，其余RNA于70 ℃超低温保存。
1.2.2 总RNA的DNaseI消化
在100μl体系中分别加入以下成分：50 μg总RNA，1 μL DNaseI，10 μL 10×DNaseI buffer (Code No. #D2215，TaKaRa大连)，1 μL RNase Inhibitor (Cat #M0250，南京生兴生物)，用DEPCH2O补足至100 μL。37 ℃温育30～60 min，然后用氯仿抽提一次，上层溶液加1/10倍体积的NaAC (pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，20 ℃放置2 h后12000 rpm离心20 min收集RNA沉淀，沉淀用70% 乙醇洗涤后真空干燥并溶解于20 μL DEPCH2O中，取1 μL溶液用核酸蛋白分析仪测定其RNA浓度。
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引言
棉纤维是重要的天然纤维纺织原料。棉纤维是从棉花胚珠外表皮细胞发育而来的。在纤维的发育过程中，前后会出现2次明显的纤维突起高峰。3 0 DPA突起的表皮细胞最终发育成商业上可利用的长纤维(lint)，而4~5 DPA左右突起的表皮细胞仅仅发育到几mm就停止伸长，称之为短绒(fuzz)的纤维。
突变体作为非常有用的研究材料有助于我们更好的研究和了解重要基因的遗传机理，作用方式及分子调控机制。目前棉花上已报道多个棉纤维突变体材料。如，李氏极短纤维突变体Li1[1]和Li2[2]；无绒有絮突变体，也称为光籽突变体N1(N1NSM)和n2(n2NSM)[3,4]；无绒无絮突变体L40[5], MCU5[6], MD17FLM[7], SL171FLM [8]以及XZ142FLM[9]。
Kohel等报道光子性状主要由两个独立的位点控制，即显性光子基因和隐性光子基因，并分别被命名为N1和n2
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
，同时N1和n2之间存在上位性作用[10]。由N1控制的光子性状比较稳定，而不同的遗传背景和生长环境对n2影响较大。Zhang 和 Pan研究认为，在控制短绒方面，正常有短绒的野生型、显性光子突变体N1和隐性光子突变体n2的基因型分别为n1n1N2N2, N1N1N2N2和n1n1n2n2[9]。Turley和Kloth研究认为还存在第三个基因n3控制光子性状，n3的显性基因N3控制短绒的生长和发育[11]。
宋丽等将N1定位在第 12 染色体上SSR标记NAU4020和BNL1679之间[12]，万群在此基础上将N1定位在更近的位置，锚定基因组后找到显性光子候选基因GhN1[13]，本研究旨在应用病毒介导的基因沉默（Virusinduced gene silencing，VIGS）、实时荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，qRTPCR）等方法来验证该基因的功能。
1 材料与方法
1.1.实验材料
本研究所用材料如下：陆地棉遗传标准系TM1和无绒有絮棉花纤维突变体N1。突变体材料的表型见图1。2014植于大学江浦试验站，4月中旬播种，五月中旬移栽，7月下旬到8月中旬为盛花期，7月31日为取材的基准点。
取材：各研究材料3 DPA，1 DPA，0 DPA，1 DPA，3 DPA，5 DPA，10 DPA，20 DPA，25 DPA胚珠和纤维以及根、茎和叶迅速置于液氮中冷冻并保存在70 ℃冰箱备用。
图1 TM1 和N1突变体的种子表型。棉花种子纤维包括长纤维（可纺织纤维）和压花后短绒如TM1，或无短绒种子如N1。标尺为1cm。
Figure 1 Cotton seeds from TM1 and N1 mutants. The wild cotton seed with fiber including lint (spinnable fiber) and fuzz seed after gins in TM1, and naked seed or fuzzlesslinted seed cotton in N1.Scale bar = 1cm.
1.2 实验方法
1.2.1 RNA的提取
RNA的提取采用改进的CTAB酸酚法[14]，具体步骤如下：1.5 ml离心管中，加5倍体积 RNA提取缓冲液(NaCl 1.4 mol/L，TrisHC l0.1 mol/L，EDTA 20 mmol/L，CTAB 2%，PVP 2%，β巯基乙醇 1%，NaCl溶解后再加入CTAB，配好后加 1% DEPC，高压灭菌)，振荡混匀，封口膜封口，匀浆仪匀浆约1 min，65 ℃水浴约20 min，中途可颠倒混和2～3次，使RNA充分析出；加0.6 倍体积的氯仿，混匀，冰浴20 min，4 ℃，10,000 rpm离心10 min，将上清液转移到另一新1.5 ml离心管中。加1/3倍体积8 mol/L LiCl溶液，混匀，冰浴(20 ℃ 6 h或70 ℃ 1 h左右)；4 ℃，10000 rpm离心20 min，弃去上清液，用70% 乙醇洗涤沉淀1次，并将沉淀转移到1.5 mL Eppendorf管中；10000 rpm离心5 min，弃去乙醇溶液，将沉淀置抽干仪(Universal Vacuum System Plus UVS400A with VaporNet?, Speed Vac? Plus SC110A, Savant)抽干；加88 ul无RNase的ddH2O，10 ul Rnase溶解沉淀，并分成两管，每管加0.6 倍体积的水饱和酚：氯仿 (1：1)，充分混匀，室温静置5 min；4 ℃，12000 rpm离心20 min，将上清液转移到另一新1.5 ml 管中，再加0.6 倍体积的水饱和酚：氯仿 (1：1)重复抽提1次；12000 rpm离心20 min，上清液加0.6倍体积的氯仿抽提 1 次；12000 rpm离心20 min，上清液加1/3倍体积8 mol/L LiCl溶液，冰浴1 h；12000 rpm离心20 min，沉淀用70 %乙醇洗涤沉淀1次，真空抽干后溶于100～200 μl无RNase的ddH2O中，取2 μl电泳和吸光值检测RNA质量，其余RNA于70 ℃超低温保存。
1.2.2 总RNA的DNaseI消化
在100μl体系中分别加入以下成分：50 μg总RNA，1 μL DNaseI，10 μL 10×DNaseI buffer (Code No. #D2215，TaKaRa大连)，1 μL RNase Inhibitor (Cat #M0250，南京生兴生物)，用DEPCH2O补足至100 μL。37 ℃温育30～60 min，然后用氯仿抽提一次，上层溶液加1/10倍体积的NaAC (pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，20 ℃放置2 h后12000 rpm离心20 min收集RNA沉淀，沉淀用70% 乙醇洗涤后真空干燥并溶解于20 μL DEPCH2O中，取1 μL溶液用核酸蛋白分析仪测定其RNA浓度。
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