银杏内生真菌的抑菌活性研究
银杏（Ginkgo biloba）为银杏科银杏属（Ginkgo）植物，是现存种子植物中最古老的孑遗植物，和它同纲的所有其他植物皆已灭绝。银杏有“活化石”之称，具有很高的研究开发价值。在其生长期间很少感染病虫害且寿命极长，从中极有可能发现具备良好活性的内生菌株。因而，研究银杏内生真菌及其次生代谢产物具有重要的理论意义和应用前景[1]。本实验采用组织分离法从健康的银杏叶片分离出内生真菌，对各菌株发酵液和萃取物浸膏进行抗菌“活性筛选”。利用有机溶剂进行萃取，浓缩得粗浸膏，采用普通硅胶柱层析、Sephedex LH-20柱层析、HPLC等方法进行分离纯化。利用现代波谱学方法鉴定所得化合物的结构。以植物病原菌为作用靶标，测定各化合物的抗菌活性从而发现结构新颖、活性显著的天然化合物。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
银杏内生真菌的分离与筛选 4
材料与方法 4
材料4
实验方法5
结果与分析5
抑菌活性测定结果5
抑菌活性结果分析7
小结与讨论8
银杏内生真菌NYW1次生代谢产物提取与研究8
1 材料与方法8
1.1 菌株来源8
1.2 溶剂与设备8
1.3 实验方法8
2 结果与分析9
菌株鉴定9
NYW1抑菌活性生物测定10
2.3 NYW1次生代谢产物的分离纯化11
3 小结与讨论11
致谢12
参考文献13
银杏内生真菌的抑菌活性研究
引言
植物内生真菌一般是指在其生活史中某一段时期生活在活的植物组织内，并且不引起明显病害症状的真菌[2]。被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在病症，可通过从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生[3]。内生真菌的存在具有普遍性和多样性。研究表明，感染了内生真菌的宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抵抗动物危害等优势，比未感染植株更具 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
有生存竞争力，其原因主要在于内生真菌可在寄主体内产生丰富多样的具有生物活性的次生代谢物，包括激素、酶、抗生素及其它杀虫抑菌物质，这些发现使得内生真菌在生物活性物质筛选的研究领域中显示出巨大的应用潜力[4]。目前从植物内生真菌中分离到的化合物主要包括生物碱类（Alkaloids）、甾体类（Steroids）、萜类（Terpenoids）、醌类（Quinones）、酚类及有机酸类（Phenols）、脂类（Esters）、肽类（Peptide）等[5]。
银杏（Ginkgo biloba）系银杏科（Ginkgoaceae）银杏属（Ginkgo）植物，落叶大乔木，为中生代孑遗的稀有树种，系我国特产，仅浙江天目山有野生状态的树木，生于海拔5001000米、酸性（pH值55.5）黄壤、排水良好地带的天然林中。银杏不仅自身无病虫害，不污染环境，而且有杀死农作物病虫之功能，尤其对叶螨、桃蚜、二化螟虫等尤其有效。根据内共生理论推断，银杏中很有可能存在着特殊的内生真菌，通过产生特殊的次生代谢产物帮助增强银杏的抗病害能力[6]。
第一章 银杏内生真菌的分离与筛选
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验菌株
大学植物保护学院天然药物化学实验室保存的银杏内生真菌菌种库。
HZW1、NYP1、NYW3、SXG1、NYW1、NYC1、SXP1、SXC1、HZC1。
1.1.2 培养基
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL；
PSB培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，水1000mL。
1.1.3 抗菌实验指示菌株
小麦赤霉病菌 Fusarium graminearum
水稻纹枯病菌 Rhizoctonia solani
油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum
辣椒疫霉病菌 Phytophthora capsici
1.1.4 主要仪器设备
高压蒸汽灭菌锅 TOMY SX500 日本
离心机 Eppendorf 5417R 德国
旋转蒸发仪 EYELA N1100 日本
核磁共振仪 Bruker DRX400 德国
超净工作台 AIRTECH SWCJ1F 江苏苏净集团
恒温培养箱 SPX128 宁波江南仪器厂
摇床 QYC2102C 宁波江南仪器厂
1.2 试验方法
1.2.1 内生真菌发酵液（FB）及发酵液乙酸乙酯粗提物（CE）的制备
用0.5cm打孔器将经活化的内生真菌制成菌饼，接种于PSB培养基中（150mL PSB/250mL三角瓶，10菌饼/瓶），25°C±1°C、150rpm摇瓶黑暗培养14d，至有大量菌丝球出现，经100目尼龙网过滤得菌体和发酵液。发酵液用乙酸乙酯萃取3次，用旋转蒸发仪浓缩蒸干，得到菌株发酵液乙酸乙酯粗提物浸膏（CE），4°C保存。
1.2.2 抗菌活性实验方法
菌丝生长抑制法
采用菌丝生长抑制法测定菌株发酵液（FB）及发酵液乙酸乙酯粗提物（CE）对四种病原菌的抑制作用。将菌株HZW1、NYP1、NYW3、SXG1、NYW1、NYC1、SXP1、SXC1、HZC1等9株银杏内生真菌的无菌发酵液10ml分别与90mlPDA培养基混合后，制成平板。同时，将该9种菌株的乙酸乙酯提取物，制成终浓度为10μg/mL的含药平板。以二甲亚砜（DMSO）为对照。用5mm打孔器将供试菌株制成菌饼，将菌饼置于上述两种培养皿中央，25°C恒温箱中黑暗培养。待对照菌株生长至培养皿边缘时，十字交叉法测量菌株直径（除去菌饼5mm），抑制率通过公式计算，其中“处理”表示含药组菌株直径，CK表示空白对照组菌株直径。DMSO（二甲基亚砜）为对照。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
银杏内生真菌的分离与筛选 4
材料与方法 4
材料4
实验方法5
结果与分析5
抑菌活性测定结果5
抑菌活性结果分析7
小结与讨论8
银杏内生真菌NYW1次生代谢产物提取与研究8
1 材料与方法8
1.1 菌株来源8
1.2 溶剂与设备8
1.3 实验方法8
2 结果与分析9
菌株鉴定9
NYW1抑菌活性生物测定10
2.3 NYW1次生代谢产物的分离纯化11
3 小结与讨论11
致谢12
参考文献13
银杏内生真菌的抑菌活性研究
引言
植物内生真菌一般是指在其生活史中某一段时期生活在活的植物组织内，并且不引起明显病害症状的真菌[2]。被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在病症，可通过从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生[3]。内生真菌的存在具有普遍性和多样性。研究表明，感染了内生真菌的宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抵抗动物危害等优势，比未感染植株更具 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
有生存竞争力，其原因主要在于内生真菌可在寄主体内产生丰富多样的具有生物活性的次生代谢物，包括激素、酶、抗生素及其它杀虫抑菌物质，这些发现使得内生真菌在生物活性物质筛选的研究领域中显示出巨大的应用潜力[4]。目前从植物内生真菌中分离到的化合物主要包括生物碱类（Alkaloids）、甾体类（Steroids）、萜类（Terpenoids）、醌类（Quinones）、酚类及有机酸类（Phenols）、脂类（Esters）、肽类（Peptide）等[5]。
银杏（Ginkgo biloba）系银杏科（Ginkgoaceae）银杏属（Ginkgo）植物，落叶大乔木，为中生代孑遗的稀有树种，系我国特产，仅浙江天目山有野生状态的树木，生于海拔5001000米、酸性（pH值55.5）黄壤、排水良好地带的天然林中。银杏不仅自身无病虫害，不污染环境，而且有杀死农作物病虫之功能，尤其对叶螨、桃蚜、二化螟虫等尤其有效。根据内共生理论推断，银杏中很有可能存在着特殊的内生真菌，通过产生特殊的次生代谢产物帮助增强银杏的抗病害能力[6]。
第一章 银杏内生真菌的分离与筛选
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验菌株
大学植物保护学院天然药物化学实验室保存的银杏内生真菌菌种库。
HZW1、NYP1、NYW3、SXG1、NYW1、NYC1、SXP1、SXC1、HZC1。
1.1.2 培养基
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL；
PSB培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，水1000mL。
1.1.3 抗菌实验指示菌株
小麦赤霉病菌 Fusarium graminearum
水稻纹枯病菌 Rhizoctonia solani
油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum
辣椒疫霉病菌 Phytophthora capsici
1.1.4 主要仪器设备
高压蒸汽灭菌锅 TOMY SX500 日本
离心机 Eppendorf 5417R 德国
旋转蒸发仪 EYELA N1100 日本
核磁共振仪 Bruker DRX400 德国
超净工作台 AIRTECH SWCJ1F 江苏苏净集团
恒温培养箱 SPX128 宁波江南仪器厂
摇床 QYC2102C 宁波江南仪器厂
1.2 试验方法
1.2.1 内生真菌发酵液（FB）及发酵液乙酸乙酯粗提物（CE）的制备
用0.5cm打孔器将经活化的内生真菌制成菌饼，接种于PSB培养基中（150mL PSB/250mL三角瓶，10菌饼/瓶），25°C±1°C、150rpm摇瓶黑暗培养14d，至有大量菌丝球出现，经100目尼龙网过滤得菌体和发酵液。发酵液用乙酸乙酯萃取3次，用旋转蒸发仪浓缩蒸干，得到菌株发酵液乙酸乙酯粗提物浸膏（CE），4°C保存。
1.2.2 抗菌活性实验方法
菌丝生长抑制法
采用菌丝生长抑制法测定菌株发酵液（FB）及发酵液乙酸乙酯粗提物（CE）对四种病原菌的抑制作用。将菌株HZW1、NYP1、NYW3、SXG1、NYW1、NYC1、SXP1、SXC1、HZC1等9株银杏内生真菌的无菌发酵液10ml分别与90mlPDA培养基混合后，制成平板。同时，将该9种菌株的乙酸乙酯提取物，制成终浓度为10μg/mL的含药平板。以二甲亚砜（DMSO）为对照。用5mm打孔器将供试菌株制成菌饼，将菌饼置于上述两种培养皿中央，25°C恒温箱中黑暗培养。待对照菌株生长至培养皿边缘时，十字交叉法测量菌株直径（除去菌饼5mm），抑制率通过公式计算，其中“处理”表示含药组菌株直径，CK表示空白对照组菌株直径。DMSO（二甲基亚砜）为对照。
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