decappingprotein2(dcp2)mrna脱帽蛋白基因沉默对tswv复制的影响
番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的典型成员。引起多种重要作物发生严重病害，导致世界范围内重大农业经济损失。脱帽酶DCP2 是mRNA脱帽机制的催化组件，DCP2的缺失会导致病毒自转录增加而不影响病毒自身MRNA稳定性。本研究试图通过构建Decapping protein 2(Dcp2) mRNA脱帽蛋白基因沉默表达载体，利用农杆菌介导浸润本氏烟叶片。浸润24小时后摩擦接种TSWV新鲜毒源，按时间梯度收集接种叶做Western检测，从而研究Dcp2对TSWV复制的影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1基本材料2
1.1.1宿主菌2
1.1.2植物材料2
1.1.3番茄斑萎病毒毒源2
1.1.4质粒载体2
1.1.5主要抗生素和试剂2
1.1.6抗体2
1.2常用培养基和溶液的配制2
1.3实验方法3
1.3.1本氏烟总RNA提取3
1.3.2合成模板cDNA3
1.3.3 DCP2模板构建4
1.3.4构建沉默表达载体6
1.3.5农杆菌处理与浸润烟草7
1.3.6 Western检测7
2结果与分析 8
2.1本氏烟总RNA中目的片段扩增、模板pGEMTNbDCP2构建、沉默表达载体p230035S:intronNbDCP2构建8
2.1.1目的基因NbDCP2的扩增8
2.1.2模板pGEMTNbDCP2的构建9
2.1.3沉默表达载体p230035S: IntronNbDCP2 dsRNA构建9
2.2 Western检测10
3讨论 10
致谢11
参考文献11
附录 11
Decapping protein 2 (D *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
cp2)mRNA 脱帽蛋白基因沉默对番茄斑萎病毒(TSWV)复制的影响
引言
番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的典型成员。TSWV寄主范围广，可侵染15个科1090种的单子叶植物，69个科的双子叶植物和一个科的蕨类植物[1]，在世界范围内每年对重要农作物造成直接经济损失达10亿美元。目前已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一[2,9]，也是一种入侵我国的危险检疫性病毒(国家质量监督检验检疫总局2006年进境植物检疫性有害生物名单)。
该病毒传播方式主要是蓟马以持久性方式传播[3]。病毒粒子球形，直径约70~90nm，表面包裹一层约5nm 厚的双层脂质包膜。病毒基因组属于负单链RNA（ssRNA类型)，由三条基因组组成，从大到小分别被称为LRNA、MRNA和SRNA[4]。其基因组RNA的极性与mRNA的极性相反，其病毒粒子的结构蛋白都由病毒基因组的反向开放阅读框编码[5]。
目前，番茄斑萎病毒的致病机理还处于研究阶段。明确TSWV的致病机理，对该种病害的防治有极其重要的意义。
作为专性细胞内病原物，病毒的编码能力有限，病毒的RNA必须高度复制并借用寄主翻译装置，同时还要避免被寄主降解，经过突变和选择，病毒进化出很多稳定自身RNA的机制[6]。真核生物mRNA 通过5 端加帽，3 端多聚腺苷化加poly( A) 尾巴，再通过帽结合蛋白与poly( A) 结合蛋白的相作，使mRNA 在空间上形成非共价闭合环状维持自身RNA 的稳定性，很多病毒RNA 通过加帽加尾形成与真核生物mRNA 相似的结构。有研究表明布尼亚病毒科(Bunyaviridae)通过加帽机制逃避宿主细胞降解。病毒先截取宿主mRNA 5 端带有帽结构的一段RNA 片段，并以此为引物，通过病毒编码的RNA 聚合酶合成病毒的RNA，结果宿主mRNA 的帽便成为了病毒mRNA的帽[7]。
布尼亚病毒科(Bunyaviridae)白蛉热病毒属(Phlebovirus)成员烈古勒病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）是一种由蚊子传播的主要感染牛、羊、骆驼等多种动物，并引起病畜死亡、流产的人畜共患病新兴病毒。Kaycie C Hopkins等人发现Decapping protein 2(Dcp2) mRNA脱帽蛋白是在mRNA脱帽机制中起催化作用的重要组分。Dcp2在果蝇和蚊子细胞内以及成蝇体内限制RVFV的复制。这种限制可能对布尼亚病毒科普遍，因为和布尼亚病毒科有远缘关系的拉克罗斯病毒也被Dcp2限制[10]。
以上结果都是在动物体内以RVFV为对象进行的。番茄斑萎病毒TSWV和烈古勒病毒RVFV同属于布尼亚病毒科，我们猜想TSWV的复制同样也受Dcp2的影响。本课题通过构建Dcp2的沉默表达载体，研究Dcp2对TSWV复制的影响。与实验室其他项目结合，不仅可为研究番茄斑萎病毒的基因功能和致病分子机理提供一个重要的研究平台，同时也将利用基因工程操作技术开辟植物负义链RNA病毒反向遗传学研究的新途径。
1 材料与方法
1．1 基本材料
1.1.1宿主菌
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株由大学病毒实验室保存，用于构建载体，扩增和保存载体；农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101，由大学植病系病毒实验室保存。
1.1.2植物材料
本实验所用烟草品种为本氏烟（Nicotiana benthamiana），由大学病毒实验室繁衍并培养。所有的本氏烟置于28℃无虫温室培养，其光照周期为16 h光照/8 h黑暗。
1.1.3番茄斑萎病毒毒源
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1基本材料2
1.1.1宿主菌2
1.1.2植物材料2
1.1.3番茄斑萎病毒毒源2
1.1.4质粒载体2
1.1.5主要抗生素和试剂2
1.1.6抗体2
1.2常用培养基和溶液的配制2
1.3实验方法3
1.3.1本氏烟总RNA提取3
1.3.2合成模板cDNA3
1.3.3 DCP2模板构建4
1.3.4构建沉默表达载体6
1.3.5农杆菌处理与浸润烟草7
1.3.6 Western检测7
2结果与分析 8
2.1本氏烟总RNA中目的片段扩增、模板pGEMTNbDCP2构建、沉默表达载体p230035S:intronNbDCP2构建8
2.1.1目的基因NbDCP2的扩增8
2.1.2模板pGEMTNbDCP2的构建9
2.1.3沉默表达载体p230035S: IntronNbDCP2 dsRNA构建9
2.2 Western检测10
3讨论 10
致谢11
参考文献11
附录 11
Decapping protein 2 (D *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
cp2)mRNA 脱帽蛋白基因沉默对番茄斑萎病毒(TSWV)复制的影响
引言
番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的典型成员。TSWV寄主范围广，可侵染15个科1090种的单子叶植物，69个科的双子叶植物和一个科的蕨类植物[1]，在世界范围内每年对重要农作物造成直接经济损失达10亿美元。目前已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一[2,9]，也是一种入侵我国的危险检疫性病毒(国家质量监督检验检疫总局2006年进境植物检疫性有害生物名单)。
该病毒传播方式主要是蓟马以持久性方式传播[3]。病毒粒子球形，直径约70~90nm，表面包裹一层约5nm 厚的双层脂质包膜。病毒基因组属于负单链RNA（ssRNA类型)，由三条基因组组成，从大到小分别被称为LRNA、MRNA和SRNA[4]。其基因组RNA的极性与mRNA的极性相反，其病毒粒子的结构蛋白都由病毒基因组的反向开放阅读框编码[5]。
目前，番茄斑萎病毒的致病机理还处于研究阶段。明确TSWV的致病机理，对该种病害的防治有极其重要的意义。
作为专性细胞内病原物，病毒的编码能力有限，病毒的RNA必须高度复制并借用寄主翻译装置，同时还要避免被寄主降解，经过突变和选择，病毒进化出很多稳定自身RNA的机制[6]。真核生物mRNA 通过5 端加帽，3 端多聚腺苷化加poly( A) 尾巴，再通过帽结合蛋白与poly( A) 结合蛋白的相作，使mRNA 在空间上形成非共价闭合环状维持自身RNA 的稳定性，很多病毒RNA 通过加帽加尾形成与真核生物mRNA 相似的结构。有研究表明布尼亚病毒科(Bunyaviridae)通过加帽机制逃避宿主细胞降解。病毒先截取宿主mRNA 5 端带有帽结构的一段RNA 片段，并以此为引物，通过病毒编码的RNA 聚合酶合成病毒的RNA，结果宿主mRNA 的帽便成为了病毒mRNA的帽[7]。
布尼亚病毒科(Bunyaviridae)白蛉热病毒属(Phlebovirus)成员烈古勒病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）是一种由蚊子传播的主要感染牛、羊、骆驼等多种动物，并引起病畜死亡、流产的人畜共患病新兴病毒。Kaycie C Hopkins等人发现Decapping protein 2(Dcp2) mRNA脱帽蛋白是在mRNA脱帽机制中起催化作用的重要组分。Dcp2在果蝇和蚊子细胞内以及成蝇体内限制RVFV的复制。这种限制可能对布尼亚病毒科普遍，因为和布尼亚病毒科有远缘关系的拉克罗斯病毒也被Dcp2限制[10]。
以上结果都是在动物体内以RVFV为对象进行的。番茄斑萎病毒TSWV和烈古勒病毒RVFV同属于布尼亚病毒科，我们猜想TSWV的复制同样也受Dcp2的影响。本课题通过构建Dcp2的沉默表达载体，研究Dcp2对TSWV复制的影响。与实验室其他项目结合，不仅可为研究番茄斑萎病毒的基因功能和致病分子机理提供一个重要的研究平台，同时也将利用基因工程操作技术开辟植物负义链RNA病毒反向遗传学研究的新途径。
1 材料与方法
1．1 基本材料
1.1.1宿主菌
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株由大学病毒实验室保存，用于构建载体，扩增和保存载体；农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101，由大学植病系病毒实验室保存。
1.1.2植物材料
本实验所用烟草品种为本氏烟（Nicotiana benthamiana），由大学病毒实验室繁衍并培养。所有的本氏烟置于28℃无虫温室培养，其光照周期为16 h光照/8 h黑暗。
1.1.3番茄斑萎病毒毒源
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