番茄抗病蛋白sw5b亚细胞定位研究
在漫长的进化过程中，植物进化出了多层的内源免疫反应来对抗各种病原物，其中，抗病蛋白介导的对病原物无毒蛋白的特异性识别并激活级联免疫反应是植物主要的防疫体系。大多数的植物抗病基因编码包含有N端结构域、核苷酸结合结构域（NB-ARC）和C端富亮氨酸富集结构域（LRR）的蛋白，被称为NB-LRR类蛋白。这类蛋白基于N端结构域的不同分为TIR-NB-LRR和CC-NB-LRR。植物免疫受体蛋白Sw-5b属于CC-NB-LRR类型，但是具有额外的N端结构域(NTD)，这一特点并不被其它大多数典型的CC-NB-LRR受体所具备。越来越多的研究表明，抗病蛋白的亚细胞定位在抗病信号通路中发挥着重要作用，然而植物抗病蛋白的定位还没有一个统一的定论。本研究围绕这个问题，开展了以下研究。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1 植物材料 4
1.1.2 质粒材料 4
1.2实验方法 4
1.2.1 YFPSw5b构建4
1.2.2 HR反应4
1.2.3共聚焦观察4
1.2.4 转基因 5
1.2.5摩擦接种病毒5
2 结果与分析5
2.1 Sw5b的结构 6
2.2 SW5b的定位 6
2.3 YFPSW5b诱导的依赖于NSm的细胞死亡情况 6
2.4 转基因并接种病毒后HR反应7
3 讨论 8
致谢9
参考文献10
番茄抗病蛋白Sw5b亚细胞定位研究
引言
番茄斑萎病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus），寄主植物非常广泛，可侵染84个科1090种植物，它是一种危害农业生产的重要病毒，在十大最具危害性的病毒中排行第二[1]。而在自然界长期进化过程中，植物通过自身复杂且完整的防御机制来抵抗病原物的侵害。番茄斑萎病毒病之所以危害严重，是因为该病毒特殊的生物学习性，能够造成该病毒大暴发的重要习性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
是该病毒的越冬特性及传播特性。番茄斑萎病毒能够依靠野生品种例如多种杂草进行越冬，而杂草的主要生物学特性是繁殖力强，难于根除，造成该病毒越冬寄主丰富，不会因为寒冷的冬季而降低侵染数量，保证了来年的侵染源。同时该病毒的传播介体是多种蓟马，蓟马的生物学特点是数量大、繁殖速度快、难于防治、迁飞能力强，而且一旦获毒终生带毒，给该病毒的传播提供了良好的介体。同时由于蓟马的活动性，致使该病毒传播距离及传播速度大幅上升，因此易造成短时间内大暴发。在受病原物侵染时，植物体内的抗病基因即能表现出抗病反应[2]。因此，通过对植物抗病基因Sw5b的深入研究，可进一步从分子水平上揭示植物的抗病机制，对于培育抗病品种，综合防治番茄斑萎病毒病具有重要的理论指导意义。
目前，植物抗病蛋白的定位还没有一个统一的定论，然而越来越多的研究表明，抗病蛋白的亚细胞定位在抗病信号通路中发挥着重要作用。抗病蛋白的定位有多种，在细胞膜、细胞质、内质网和细胞核等都有定位。通常认为,分子量小于45kD的生物大分子可以通过自由扩散出入细胞核的核孔,从而在核质之间扩散。分子量大的生物大分子出入核孔则需要特定的亚细胞定位信号，或者其它主动运输机制。植物NBLRR受体往往属于分子量较大的蛋白质，它们不能通过自由扩散进出细胞核，但是我们知道DNA的复制与转录等生命活动均在核内，转录后的mRNA需要转运到细胞质中完成蛋白质的翻译，而翻译修饰过程也需要经过很多细胞器（例如细胞核，内质网，高尔基体和线粒体等）的修饰和加工。在这些细胞器中转移运输需要不同的机制，比如蛋白在细胞核与细胞质的穿梭会受到核膜的阻挡，就需要核输出和输入受体及小G蛋白Ran等的协助，通过核孔复合体进行运输[3]。
大多数的R蛋白没有经典的核定位信号，因此最初人们认为这类受体主要定位在细胞质中。随着大量的蛋白质亚细胞定位预测软件的发展和应用，人们对NBLRR受体的胞内定位有了更多的认识。例如LocTree程序[4]；NucPred程序[5]等，Meyers等利用LocTree程序预测拟南芥中假定的154个NBLRR受体的定位情况，结果显示拟南芥NBLRR受体中超过80%以上可能定位于细胞核内，仅有8.4%可能定位于细胞质中，还有8.4%定位在叶绿体。Jeffrey Caplan等利用NucPred程序对已克隆的部分免疫受体进行了核定位信号预测[6]，一些NBLRR受体具有明显的核定位信号，如烟草花叶病毒的抗性蛋白N[7]；拟南芥的抗性蛋白RRS1、RPS4[8]，拟南芥Rpm1有核定位信号却定位在质膜[9]。然而有一部分NBLRR受体虽没有典型的核定位信号，但经实验证明这些NBLRR受体定位到细胞核，如大麦抗白粉病的MLA10[10]；马铃薯X病毒抗性蛋白Rx[11]。本论文研究对象Sw5b也没有核定位信号。
NBLRR蛋白是最大的一类R蛋白[12]，是属于多结构域的蛋白，这些结构域包括N端结构域、中心的NBARC结构域、C端的LRR结构域。植物NBLRR蛋白根据N端结构的不同分为两类：包含CC结构域的CCNBLRR和包含TIR结构域的TIRNBLRR[13]。SW5b已被鉴定为具有功能的基因拷贝，其编码的蛋白Sw5b是番茄上对番茄斑萎病毒具有免疫作用的一个CCNBLRR类型的免疫受体蛋白，但它在N端进化出了一个额外的结构域（Nterminal domain, NTD），Sw5b不仅抗TSWV，它对番茄斑萎病毒属的其他病毒具有广谱抗性。
材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
本氏烟在16h光照8h黑暗温度24±1℃条件的温室栽培
1．1．2 引物
引物1:：PV953
YFPKpnIF
GGGGTACCatggtgagcaagggcgagg
引物2：PV954
YFP without stop codonR
agatctgtacagctcgtcca
引物3：PV955
Sw5b:YFP fusionF
tggacgagctgtacagatctAtggctgaaaatgaaattgag
引物4：PV956
Sw5b_245264R
Cctttctagattaaggttag
1．2 实验方法
1．2．1 YFPSw5b构建
p2300SSw5b是由抗病番茄提取DNA克隆到p2300S（实验室师姐提供）得到的。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1 植物材料 4
1.1.2 质粒材料 4
1.2实验方法 4
1.2.1 YFPSw5b构建4
1.2.2 HR反应4
1.2.3共聚焦观察4
1.2.4 转基因 5
1.2.5摩擦接种病毒5
2 结果与分析5
2.1 Sw5b的结构 6
2.2 SW5b的定位 6
2.3 YFPSW5b诱导的依赖于NSm的细胞死亡情况 6
2.4 转基因并接种病毒后HR反应7
3 讨论 8
致谢9
参考文献10
番茄抗病蛋白Sw5b亚细胞定位研究
引言
番茄斑萎病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus），寄主植物非常广泛，可侵染84个科1090种植物，它是一种危害农业生产的重要病毒，在十大最具危害性的病毒中排行第二[1]。而在自然界长期进化过程中，植物通过自身复杂且完整的防御机制来抵抗病原物的侵害。番茄斑萎病毒病之所以危害严重，是因为该病毒特殊的生物学习性，能够造成该病毒大暴发的重要习性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
是该病毒的越冬特性及传播特性。番茄斑萎病毒能够依靠野生品种例如多种杂草进行越冬，而杂草的主要生物学特性是繁殖力强，难于根除，造成该病毒越冬寄主丰富，不会因为寒冷的冬季而降低侵染数量，保证了来年的侵染源。同时该病毒的传播介体是多种蓟马，蓟马的生物学特点是数量大、繁殖速度快、难于防治、迁飞能力强，而且一旦获毒终生带毒，给该病毒的传播提供了良好的介体。同时由于蓟马的活动性，致使该病毒传播距离及传播速度大幅上升，因此易造成短时间内大暴发。在受病原物侵染时，植物体内的抗病基因即能表现出抗病反应[2]。因此，通过对植物抗病基因Sw5b的深入研究，可进一步从分子水平上揭示植物的抗病机制，对于培育抗病品种，综合防治番茄斑萎病毒病具有重要的理论指导意义。
目前，植物抗病蛋白的定位还没有一个统一的定论，然而越来越多的研究表明，抗病蛋白的亚细胞定位在抗病信号通路中发挥着重要作用。抗病蛋白的定位有多种，在细胞膜、细胞质、内质网和细胞核等都有定位。通常认为,分子量小于45kD的生物大分子可以通过自由扩散出入细胞核的核孔,从而在核质之间扩散。分子量大的生物大分子出入核孔则需要特定的亚细胞定位信号，或者其它主动运输机制。植物NBLRR受体往往属于分子量较大的蛋白质，它们不能通过自由扩散进出细胞核，但是我们知道DNA的复制与转录等生命活动均在核内，转录后的mRNA需要转运到细胞质中完成蛋白质的翻译，而翻译修饰过程也需要经过很多细胞器（例如细胞核，内质网，高尔基体和线粒体等）的修饰和加工。在这些细胞器中转移运输需要不同的机制，比如蛋白在细胞核与细胞质的穿梭会受到核膜的阻挡，就需要核输出和输入受体及小G蛋白Ran等的协助，通过核孔复合体进行运输[3]。
大多数的R蛋白没有经典的核定位信号，因此最初人们认为这类受体主要定位在细胞质中。随着大量的蛋白质亚细胞定位预测软件的发展和应用，人们对NBLRR受体的胞内定位有了更多的认识。例如LocTree程序[4]；NucPred程序[5]等，Meyers等利用LocTree程序预测拟南芥中假定的154个NBLRR受体的定位情况，结果显示拟南芥NBLRR受体中超过80%以上可能定位于细胞核内，仅有8.4%可能定位于细胞质中，还有8.4%定位在叶绿体。Jeffrey Caplan等利用NucPred程序对已克隆的部分免疫受体进行了核定位信号预测[6]，一些NBLRR受体具有明显的核定位信号，如烟草花叶病毒的抗性蛋白N[7]；拟南芥的抗性蛋白RRS1、RPS4[8]，拟南芥Rpm1有核定位信号却定位在质膜[9]。然而有一部分NBLRR受体虽没有典型的核定位信号，但经实验证明这些NBLRR受体定位到细胞核，如大麦抗白粉病的MLA10[10]；马铃薯X病毒抗性蛋白Rx[11]。本论文研究对象Sw5b也没有核定位信号。
NBLRR蛋白是最大的一类R蛋白[12]，是属于多结构域的蛋白，这些结构域包括N端结构域、中心的NBARC结构域、C端的LRR结构域。植物NBLRR蛋白根据N端结构的不同分为两类：包含CC结构域的CCNBLRR和包含TIR结构域的TIRNBLRR[13]。SW5b已被鉴定为具有功能的基因拷贝，其编码的蛋白Sw5b是番茄上对番茄斑萎病毒具有免疫作用的一个CCNBLRR类型的免疫受体蛋白，但它在N端进化出了一个额外的结构域（Nterminal domain, NTD），Sw5b不仅抗TSWV，它对番茄斑萎病毒属的其他病毒具有广谱抗性。
材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
本氏烟在16h光照8h黑暗温度24±1℃条件的温室栽培
1．1．2 引物
引物1:：PV953
YFPKpnIF
GGGGTACCatggtgagcaagggcgagg
引物2：PV954
YFP without stop codonR
agatctgtacagctcgtcca
引物3：PV955
Sw5b:YFP fusionF
tggacgagctgtacagatctAtggctgaaaatgaaattgag
引物4：PV956
Sw5b_245264R
Cctttctagattaaggttag
1．2 实验方法
1．2．1 YFPSw5b构建
p2300SSw5b是由抗病番茄提取DNA克隆到p2300S（实验室师姐提供）得到的。
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