xocstraingd41tale基因的筛选
水稻是中国第一大粮食作物，其产量占中国粮食产量的40%左右。由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，Xoc）引起的水稻细菌性条斑病（bacterial leaf streak，BLS）已发展成为水稻的第四大病害。研究表明Xoc的毒力主要依靠III型分泌系统所分泌的效应物。类转录激活因子（transcription activator-like effectors, Tales）是来自黄单胞菌属的一类III型效应因子。为了解水稻细菌性条斑病菌菌株GD41中含有Tale家族基因的情况，本研究在已构建的GD41 Tale基因组文库的基础上，通过Southern杂交分析，得到111个独立克隆。这111个克隆中大约含有30个不同的Tale家族基因。本研究基本明确了菌株GD41基因组中Tale基因的数量，并为进一步研究菌株GD41中Tale基因的功能奠定基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1供试菌株与质粒 3
1.2培养基 3
1.3所用抗生素浓度 3
1.4主要试剂 3
1.5tal基因SphI片段阳性克隆获取 4
1.5.1 热转化 4
1.5.2质粒DNA的提取 4
1.5.3 SphI酶酶切质粒DNA 4
1.5.4 探针的标记及定量标记反应效率 5
1.5.5 菌落原位杂交 6
1.6 阳性克隆的验证 — Southern印迹杂交 8
2 结果与分析 9
2.1探针的获得 9
2.2菌落原位杂交分析菌株GD41文库克隆中的tal家族基因 9
2.3获得含有tal基因片段的阳性克隆 11
2.4酶切Southern杂交分析菌株GD41文库克隆中的tal家族基因 11
3 讨论 12
致谢 15
参考文献： 15
Xoc strain GD41 Tale基因的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
筛选
引言
引言
水稻是中国的主要粮食作物，其中稻黄单胞菌稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）水稻黄单胞菌引起的白叶枯病（bacterial leaf blight， BLB）、和稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，Xoc）引起的细菌性条斑病（bacterial leaf streak，BLS），对稻米的生产安全构成极大危害[1]。
在植物病原黄单胞菌中存在类转录激活因子(transcription activatorlike effector，Tale)，最早因为其保守结构特点、促进病害产生或诱导植物的抗性功能的发现，被称做命名为avrBs3/pthA基因家族 [2]。水稻白叶枯病菌Xoo在侵染植物之后，Tale通过Ⅲ型泌出系统( T3SS)注入寄主细胞中，通过其核酸结合和转录激活活性产生转录因子的效应，调控寄主抗病基因或感病基因的表达，进而达到对水稻抗/感病性（Resistance/Susceptibility）的控制。
除了黄单胞菌中基因组中存在数量不等的Tale基因外，在部分罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)的突变型个体中也存在Tale的近缘蛋白, 这些蛋白在致病菌侵染植物体时也是通过III型分泌系统转运到宿主细胞中, 但是对于这些蛋白中有没有产生转录激活因子的作用还没有明确结论[3]。世界上首先发现的Tale 基因是从辣椒斑点病菌（X. campestris pv. vesicatoria，Xcv）中发现的avr Bs3，之后依次在棉花细菌性角斑病菌（X. axonopodis pv. malvacearum，Xcm）（6—8个）、柑橘溃疡病菌（X. citri subpv. citri，Xcc）（1—4个）和稻黄单胞菌中发现。水稻黄单胞菌中存在更多的Tale基因可能是应为长期人工驯化的栽培水稻，协同进化使稻黄单胞菌产生了更多的Tale 基因以适应水稻的遗传变化[1]，因此Tale基因也是病原菌生存适应力的体现。
N端是T3SS分泌转运信号(Aminoterminal translocation signal)，与TALE泌出有关；CRR区后是T3SS分子伴侣蛋白结合位点TFB (Transcription factor binding site)；C端具有13个核定位信号NLS (Nuclear localization signals)和1个酸性转录激活区AAD (Acidic activation domain)，与蛋白的细胞定位和转录激活功能有关[3]。TALE识别核酸，是由蛋白中心区3335个氨基酸正向重复组成的CRR（Central repeat region）中高度变异的第12和第13个氨基酸组成的RVD (Repeat variable diresidue)决定，一个RVD结合一个核酸[4]。被Tale基因识别的核酸序列叫做EBE（Effector binding element）在RVD序列的多态性是Tales功能多样性的基础，这就对于研究在不同区域内的水稻和病菌的协同进化是有重要意义的 [5]。
经过确认的具有无毒活性的tal基因分别是avrBs3、avrBs4、avrBs5、avrXa7、avrXa10、avrXa27[6]。tal基因家族中表现为毒性的有avrXa7、pthXo1、pthXo2和pthXo3。其中，pthXo1是PXO99A的主要致病因子[21]，pthXo2是PXO71菌株的主要毒性基因，pthXo3存在于PXO61中[6]。
据相关研究表明，某些tal基因兼备毒力和无毒力两种功能。例如隶属于OS198的talR26.5基因。OS198是水稻白叶枯菌中国系统6号小种的代表菌株，在大多数的水稻品种上该菌株表现为弱毒力，即病斑长度不长。在研究中发现PXO99A在测试的22个水稻种类上都显现出强的毒力功能，OS198却表现出弱毒力。把talR26.5转入PXO99A中，发现talR26.5有降低PXO99A毒力的作用，但不能到使PXO99A毒力下降到到OS198的水平。同时发现talR26.5具备诱导水稻抗性的作用。在IRBB7上，OS198却表现为低毒力，talR26.5无法减弱PXO99A在IRBB7上的毒力，结果表明talR26.7在IRBB7上可能有毒力，说明基因的功能受到水稻遗传背景的影响，在OS198中，其他无毒基因的作用可能大于talR26.7的毒力作用[9]。
水稻白叶枯病菌PXO99A基因组包含19个tal基因，但还有一些tal基因功能还不清楚，研究者对tal4基因缺失突变菌株多个表型进行了测定，包括在寄主水稻上的毒力，对温度、盐、酸碱等胁迫的反应以及对杀菌剂的敏感性，等来挖掘tal4基因的功能。发现PXO99A中的tal4基因的缺失对病原菌的毒力没有明显影响，但是tal4基因缺失，导致水稻白叶枯病菌对噻唑类杀菌剂噻枯唑的敏感性增强，这说明tal4基因在病原菌对杀菌剂抗药性中起一定的作用。该研究中的突变是针对tal4基因构建的，且tal4编码基因可以恢复PXO99Δtal4改变了的表型，由此可见，本研究中PXO99Δtal4 对噻枯唑的敏感性改变和tal基因有关[11]，所以tal基因可能对细菌的代谢功能有影响。
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1供试菌株与质粒 3
1.2培养基 3
1.3所用抗生素浓度 3
1.4主要试剂 3
1.5tal基因SphI片段阳性克隆获取 4
1.5.1 热转化 4
1.5.2质粒DNA的提取 4
1.5.3 SphI酶酶切质粒DNA 4
1.5.4 探针的标记及定量标记反应效率 5
1.5.5 菌落原位杂交 6
1.6 阳性克隆的验证 — Southern印迹杂交 8
2 结果与分析 9
2.1探针的获得 9
2.2菌落原位杂交分析菌株GD41文库克隆中的tal家族基因 9
2.3获得含有tal基因片段的阳性克隆 11
2.4酶切Southern杂交分析菌株GD41文库克隆中的tal家族基因 11
3 讨论 12
致谢 15
参考文献： 15
Xoc strain GD41 Tale基因的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
筛选
引言
引言
水稻是中国的主要粮食作物，其中稻黄单胞菌稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）水稻黄单胞菌引起的白叶枯病（bacterial leaf blight， BLB）、和稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，Xoc）引起的细菌性条斑病（bacterial leaf streak，BLS），对稻米的生产安全构成极大危害[1]。
在植物病原黄单胞菌中存在类转录激活因子(transcription activatorlike effector，Tale)，最早因为其保守结构特点、促进病害产生或诱导植物的抗性功能的发现，被称做命名为avrBs3/pthA基因家族 [2]。水稻白叶枯病菌Xoo在侵染植物之后，Tale通过Ⅲ型泌出系统( T3SS)注入寄主细胞中，通过其核酸结合和转录激活活性产生转录因子的效应，调控寄主抗病基因或感病基因的表达，进而达到对水稻抗/感病性（Resistance/Susceptibility）的控制。
除了黄单胞菌中基因组中存在数量不等的Tale基因外，在部分罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)的突变型个体中也存在Tale的近缘蛋白, 这些蛋白在致病菌侵染植物体时也是通过III型分泌系统转运到宿主细胞中, 但是对于这些蛋白中有没有产生转录激活因子的作用还没有明确结论[3]。世界上首先发现的Tale 基因是从辣椒斑点病菌（X. campestris pv. vesicatoria，Xcv）中发现的avr Bs3，之后依次在棉花细菌性角斑病菌（X. axonopodis pv. malvacearum，Xcm）（6—8个）、柑橘溃疡病菌（X. citri subpv. citri，Xcc）（1—4个）和稻黄单胞菌中发现。水稻黄单胞菌中存在更多的Tale基因可能是应为长期人工驯化的栽培水稻，协同进化使稻黄单胞菌产生了更多的Tale 基因以适应水稻的遗传变化[1]，因此Tale基因也是病原菌生存适应力的体现。
N端是T3SS分泌转运信号(Aminoterminal translocation signal)，与TALE泌出有关；CRR区后是T3SS分子伴侣蛋白结合位点TFB (Transcription factor binding site)；C端具有13个核定位信号NLS (Nuclear localization signals)和1个酸性转录激活区AAD (Acidic activation domain)，与蛋白的细胞定位和转录激活功能有关[3]。TALE识别核酸，是由蛋白中心区3335个氨基酸正向重复组成的CRR（Central repeat region）中高度变异的第12和第13个氨基酸组成的RVD (Repeat variable diresidue)决定，一个RVD结合一个核酸[4]。被Tale基因识别的核酸序列叫做EBE（Effector binding element）在RVD序列的多态性是Tales功能多样性的基础，这就对于研究在不同区域内的水稻和病菌的协同进化是有重要意义的 [5]。
经过确认的具有无毒活性的tal基因分别是avrBs3、avrBs4、avrBs5、avrXa7、avrXa10、avrXa27[6]。tal基因家族中表现为毒性的有avrXa7、pthXo1、pthXo2和pthXo3。其中，pthXo1是PXO99A的主要致病因子[21]，pthXo2是PXO71菌株的主要毒性基因，pthXo3存在于PXO61中[6]。
据相关研究表明，某些tal基因兼备毒力和无毒力两种功能。例如隶属于OS198的talR26.5基因。OS198是水稻白叶枯菌中国系统6号小种的代表菌株，在大多数的水稻品种上该菌株表现为弱毒力，即病斑长度不长。在研究中发现PXO99A在测试的22个水稻种类上都显现出强的毒力功能，OS198却表现出弱毒力。把talR26.5转入PXO99A中，发现talR26.5有降低PXO99A毒力的作用，但不能到使PXO99A毒力下降到到OS198的水平。同时发现talR26.5具备诱导水稻抗性的作用。在IRBB7上，OS198却表现为低毒力，talR26.5无法减弱PXO99A在IRBB7上的毒力，结果表明talR26.7在IRBB7上可能有毒力，说明基因的功能受到水稻遗传背景的影响，在OS198中，其他无毒基因的作用可能大于talR26.7的毒力作用[9]。
水稻白叶枯病菌PXO99A基因组包含19个tal基因，但还有一些tal基因功能还不清楚，研究者对tal4基因缺失突变菌株多个表型进行了测定，包括在寄主水稻上的毒力，对温度、盐、酸碱等胁迫的反应以及对杀菌剂的敏感性，等来挖掘tal4基因的功能。发现PXO99A中的tal4基因的缺失对病原菌的毒力没有明显影响，但是tal4基因缺失，导致水稻白叶枯病菌对噻唑类杀菌剂噻枯唑的敏感性增强，这说明tal4基因在病原菌对杀菌剂抗药性中起一定的作用。该研究中的突变是针对tal4基因构建的，且tal4编码基因可以恢复PXO99Δtal4改变了的表型，由此可见，本研究中PXO99Δtal4 对噻枯唑的敏感性改变和tal基因有关[11]，所以tal基因可能对细菌的代谢功能有影响。
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