稻曲菌分生孢子形成调控基因uvspo1表达特征及其功能验证
稻曲病严重影响水稻的产量和品质。稻曲菌可通过产生薄壁分生孢子快速增殖并侵染水稻。在前期研究中获得了稻曲菌产分生孢子能力增强的T-DNA插入突变体A204，并确认其T-DNA插入至Uv-spo1基因编码区上游的转录调控区域。为进一步验证Uv-spo1基因在稻曲菌产分生孢子过程中的功能。本研究利用qRT-PCR方法测定了稻曲菌在YT培养液中摇培产生分生孢子过程中的Uv-spo1基因表达特征，并首次采用农杆菌介导遗传转化并结合正负筛选标记的方法对稻曲菌Uv-spo1基因进行了敲除试验，并获得了1株稻曲菌Uv-spo1基因敲除突变体Dspo1-51。结果表明，Uv-spo1基因在分生孢子大量形成时未能检测到其mRNA，在分生孢子形成平台期检测到了该基因表达；与野生型菌株P-1相比，Uv-spo1敲除突变体Dspo1-51在YT培养液中产分生孢子数量为野生型菌株的2倍，且其产孢速率高峰期提前了24h。初步明确Uv-spo1为稻曲菌产分生孢子的负调控因子。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验试剂和培养基2
1.1.1 培养基 2
1.1.2实验试剂2
1.2实验仪器2
1.3稻曲菌基因组DNA提取2
1.3.1稻曲菌菌株2
1.3.2稻曲菌基因组DNA提取2
1.4 Uvspo1功能结构域预测3
1.5 Uvspo1的表达特征3
1.5.1 RNA的提取和检测3
1.5.2 cDNA第一条链的合成3
1.5.3 qRTPCR4
1.5.3数据的统计学分析4
1.6 Uvspo1基因敲除验证4
1.6.1稻曲菌Uvspo1基因敲除载体构建4
1.6.2敲除转化5
1.6.3敲除突变体筛选6
1.6.4敲除突变体验证6
1.6.5生物学性状测定7
2 结果与分析8
2.1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
Uvspo1功能结构域预测8
2.2 Uvspo1表达特征8
2.3 Uvspo1功能验证9
2.3.1 Uvspo1基因敲除载体构建9
2.3.2敲除突变体筛选10
2.3.3敲除突变体验证10
2.3.4生物学性状测定10
3 讨论12
致谢12
参考文献13
附录A 试验中所使用的培养基及试剂的配制方法14
稻曲菌分生孢子形成调控基因Uvspo1表达特征及其功能验证
引言
引言：水稻稻曲病在我国很早就有记载，最早记载在李时珍《本草纲目》卷二十七“粳谷奴”，并注为“谷穗煤黑者” [1]，当时农民把此粳谷奴作为丰收的象征，故古代的中国又称其为丰年谷、丰年穗。上个世纪80年代开始，稻曲病发生开始普遍，但一直作为次要水稻病害进行防治[2]。然而近年来随着高产水稻品种的育成和推广，加上氮肥的过量使用，稻曲病日益严重[3]。
稻曲病主要危害水稻的穗部[5]，病原菌为绿核菌，其有性阶段为Villosiclava virens (Nakata) E. Tanaka & C. Tanaka[6]，无性阶段为Ustilaginoidea virens (Cooke) Takahashi[7]，寄主植物除水稻外还有玉米等禾本科植物[8]。稻曲菌侵染后在穗部形成黄色至墨绿色的稻曲球。稻曲菌发病后不仅会影响发病谷粒，而且会影响养分的运输，使相邻的谷粒发育受到影响，尤其是对接近主轴的谷粒影响显著[9] 增加产量损失增加，流行年份病重田块产量损失可高达26.9%[4]。此外，稻曲球还含有毒素，稻曲菌不仅对水稻种子萌发、幼苗的生长及愈伤组织的生长都具有毒害作用[10,11]稻曲菌而且对人和动物也具有毒害作用。目前研究指出可分离出6种毒素，分别是UstiloxinA、UstiloxinB、UstiloxinC、UstiloxinD、UstiloxinE 和UstiloxinF，而且这些毒素中有5种结构已经被确定[12]，化学结构是含有13个环心和一个手性的叔烷基芳香基乙醚键结构的多肽[13，14]这些毒素有一个共同的特征就是具有抑制微管聚合的活性[15],对人和动物都具有活性。
稻曲球表面着生大量厚垣孢子，后期可形成菌核，菌核成熟后易脱落，厚垣孢子和菌核都可休眠越冬[1618]。其中菌核可萌发产生菌丝或形成子座，子囊壳半埋生于子座表面，成熟后每个子囊可产生8个子囊孢子[19]。目前普遍认为，水稻的孕穗期至破口期是稻曲菌侵染水稻花器的关键时期[17, 20, 21]，但对于其初侵染源仍存在很大争议。早期认为稻曲病的初侵染源为子囊孢子[16]，近年的研究表明：稻曲菌的子囊孢子、厚垣孢子和分生孢子都可以作为接种体侵染水稻花序[2226]；稻曲菌子囊孢子互相缠绕，释放比较困难，自然条件下有可能先萌发产生分生孢子，进而侵染水稻和其它寄主[19]；稻曲菌厚垣孢子细胞壁厚，原生质浓缩，抗逆性强，可在土表存活6个月以上，厚垣孢子萌发可产生菌丝或直接产生分生孢子，有可能作为越冬后的初侵染源[1618, 27, 28]；由于菌核的产生受诸多因素限制，厚垣孢子应为主要的初侵染源[29]；由于子囊孢子和厚垣孢子萌发后均可直接产生大量分生孢子，分生孢子又可萌发直接形成新一代分生孢子[30]，因此，分生孢子在病原菌快速增殖和侵染寄主的过程中应具有重要作用。
稻曲菌前期研究中获得一株高产分生孢子的TDNA插入突变体A204，发现其TDNA插入至Uvspo1基因上游调控区干扰了基因正常表达，从而可能影响分生孢子形成。本研究试图通过基因敲除方法验证Uvspo1基因在产孢过程中的功能。鉴于前期研究中尝试使用PEG介导的原生质体转化方法效率极低，而农杆菌介导的TDNA转化方法可稳定高效获得转化子，因此本研究采用农杆菌介导TDNA转化方法进行基因敲除验证工作。
1 材料与方法
1．1 实验试剂和培养基
1．1．1 培养基
PSA培养基、CM培养基、MM培养基、2%TB3培养基、YT培养基、PS培养基、LB培养基
1．1．2 实验试剂
RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒SYBR? Premix Ex Taq? Ⅱ、2%CTAB溶液、氯仿、异丙醇、乙醇（70%）、无水乙醇、DEPC处理的超纯水
液氮
1．2 实验仪器
RealTime PCR仪、离心机、培养箱、分光光度计，恒温金属浴，PCR扩增仪（PTC200）
研钵
1. 3 稻曲菌基因组DNA提取
1. 3. 1 稻曲菌菌株
田间野生型稻曲菌菌株P1。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验试剂和培养基2
1.1.1 培养基 2
1.1.2实验试剂2
1.2实验仪器2
1.3稻曲菌基因组DNA提取2
1.3.1稻曲菌菌株2
1.3.2稻曲菌基因组DNA提取2
1.4 Uvspo1功能结构域预测3
1.5 Uvspo1的表达特征3
1.5.1 RNA的提取和检测3
1.5.2 cDNA第一条链的合成3
1.5.3 qRTPCR4
1.5.3数据的统计学分析4
1.6 Uvspo1基因敲除验证4
1.6.1稻曲菌Uvspo1基因敲除载体构建4
1.6.2敲除转化5
1.6.3敲除突变体筛选6
1.6.4敲除突变体验证6
1.6.5生物学性状测定7
2 结果与分析8
2.1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
Uvspo1功能结构域预测8
2.2 Uvspo1表达特征8
2.3 Uvspo1功能验证9
2.3.1 Uvspo1基因敲除载体构建9
2.3.2敲除突变体筛选10
2.3.3敲除突变体验证10
2.3.4生物学性状测定10
3 讨论12
致谢12
参考文献13
附录A 试验中所使用的培养基及试剂的配制方法14
稻曲菌分生孢子形成调控基因Uvspo1表达特征及其功能验证
引言
引言：水稻稻曲病在我国很早就有记载，最早记载在李时珍《本草纲目》卷二十七“粳谷奴”，并注为“谷穗煤黑者” [1]，当时农民把此粳谷奴作为丰收的象征，故古代的中国又称其为丰年谷、丰年穗。上个世纪80年代开始，稻曲病发生开始普遍，但一直作为次要水稻病害进行防治[2]。然而近年来随着高产水稻品种的育成和推广，加上氮肥的过量使用，稻曲病日益严重[3]。
稻曲病主要危害水稻的穗部[5]，病原菌为绿核菌，其有性阶段为Villosiclava virens (Nakata) E. Tanaka & C. Tanaka[6]，无性阶段为Ustilaginoidea virens (Cooke) Takahashi[7]，寄主植物除水稻外还有玉米等禾本科植物[8]。稻曲菌侵染后在穗部形成黄色至墨绿色的稻曲球。稻曲菌发病后不仅会影响发病谷粒，而且会影响养分的运输，使相邻的谷粒发育受到影响，尤其是对接近主轴的谷粒影响显著[9] 增加产量损失增加，流行年份病重田块产量损失可高达26.9%[4]。此外，稻曲球还含有毒素，稻曲菌不仅对水稻种子萌发、幼苗的生长及愈伤组织的生长都具有毒害作用[10,11]稻曲菌而且对人和动物也具有毒害作用。目前研究指出可分离出6种毒素，分别是UstiloxinA、UstiloxinB、UstiloxinC、UstiloxinD、UstiloxinE 和UstiloxinF，而且这些毒素中有5种结构已经被确定[12]，化学结构是含有13个环心和一个手性的叔烷基芳香基乙醚键结构的多肽[13，14]这些毒素有一个共同的特征就是具有抑制微管聚合的活性[15],对人和动物都具有活性。
稻曲球表面着生大量厚垣孢子，后期可形成菌核，菌核成熟后易脱落，厚垣孢子和菌核都可休眠越冬[1618]。其中菌核可萌发产生菌丝或形成子座，子囊壳半埋生于子座表面，成熟后每个子囊可产生8个子囊孢子[19]。目前普遍认为，水稻的孕穗期至破口期是稻曲菌侵染水稻花器的关键时期[17, 20, 21]，但对于其初侵染源仍存在很大争议。早期认为稻曲病的初侵染源为子囊孢子[16]，近年的研究表明：稻曲菌的子囊孢子、厚垣孢子和分生孢子都可以作为接种体侵染水稻花序[2226]；稻曲菌子囊孢子互相缠绕，释放比较困难，自然条件下有可能先萌发产生分生孢子，进而侵染水稻和其它寄主[19]；稻曲菌厚垣孢子细胞壁厚，原生质浓缩，抗逆性强，可在土表存活6个月以上，厚垣孢子萌发可产生菌丝或直接产生分生孢子，有可能作为越冬后的初侵染源[1618, 27, 28]；由于菌核的产生受诸多因素限制，厚垣孢子应为主要的初侵染源[29]；由于子囊孢子和厚垣孢子萌发后均可直接产生大量分生孢子，分生孢子又可萌发直接形成新一代分生孢子[30]，因此，分生孢子在病原菌快速增殖和侵染寄主的过程中应具有重要作用。
稻曲菌前期研究中获得一株高产分生孢子的TDNA插入突变体A204，发现其TDNA插入至Uvspo1基因上游调控区干扰了基因正常表达，从而可能影响分生孢子形成。本研究试图通过基因敲除方法验证Uvspo1基因在产孢过程中的功能。鉴于前期研究中尝试使用PEG介导的原生质体转化方法效率极低，而农杆菌介导的TDNA转化方法可稳定高效获得转化子，因此本研究采用农杆菌介导TDNA转化方法进行基因敲除验证工作。
1 材料与方法
1．1 实验试剂和培养基
1．1．1 培养基
PSA培养基、CM培养基、MM培养基、2%TB3培养基、YT培养基、PS培养基、LB培养基
1．1．2 实验试剂
RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒SYBR? Premix Ex Taq? Ⅱ、2%CTAB溶液、氯仿、异丙醇、乙醇（70%）、无水乙醇、DEPC处理的超纯水
液氮
1．2 实验仪器
RealTime PCR仪、离心机、培养箱、分光光度计，恒温金属浴，PCR扩增仪（PTC200）
研钵
1. 3 稻曲菌基因组DNA提取
1. 3. 1 稻曲菌菌株
田间野生型稻曲菌菌株P1。
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