黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的筛选
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottlemosaic virus，CGMMV)是烟草花叶病毒属(To—bamovirus)葫芦科的重要病毒之一,给葫芦科农作物的生产造成严重危害。其在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋州等多个国家和地区分布广泛。高效的病毒鉴定和检测手段是防治该病毒引起的病害的基础之一。本课题原核表达系统表达CGMMV全长外壳蛋白，将纯化的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)制剂免疫BALB/c小鼠，最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞融合，经采用选择性培养基、有限稀释法克隆和间接ELISA方法进行筛选，利用单抗杂交瘤细胞株的培养上清建立了检测CGMMV的ELISA方法，为该病毒的田间检测及进出口检疫提供技术支撑。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言3
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.2 载体和宿主菌 3
1.3抗原制备蛋白原核表达3
1.3.1自动诱导法3
1.3.2蛋白纯化Ni柱纯化3
1.4免疫老鼠3
1.5融合小鼠的选择及效价测定4
1.5.1方法一：酶联免疫吸附分析（ELISA96孔板）4
1.5.2方法二：酶联免疫吸附分析（硝酸纤维素膜）4
1.6 杂交瘤细胞的制备 4
1.6.1 骨髓瘤细胞SP2/0的复苏及培养 4
1.6.2 饲养细胞的制备 5
1.6.3 免疫脾细胞的制备 5
1.6.4 细胞融合 5
1.6.5 融合细胞的培养 5
1.7 检测抗体是否可以检测植株内病毒 6
1.7.1 SDS－PAGE电泳6
1.7.3 转膜 6
1.7.3 免疫反应6
1.7.4 凝胶图象分析7
2 结果与分析 7
2．1 原核表达CGMMVN 7
2．2 选择融合小鼠 7
3 讨论 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
8
致谢8
参考文献9
黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的筛选
引言
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottlemosaic virus，CGMMV)是烟草花叶病毒属(To—bamovirus)葫芦科的重要病毒之一,给葫芦科农作物的生产造成严重危害。CGMWV在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋州等多个国家和地区广泛分布，CGMMV由Ainsworth首次记述[1]，主要分布在希腊(克里特岛)[2]、罗马尼亚[3]、中国台湾[4]、巴西(Sao Francisco地区)[5]、前苏联[6]、日本[7]、伊朗[8]、丹麦[9]、印度(Delhi) [10]、芬兰[11]、德国[12]、英国[13]、沙特阿拉伯[14]、韩国[15]、以色列[16]、波兰[17]。CGMMV的自然寄主主要为葫芦科作物，包括黄瓜[3]、葫芦[4]、甜瓜[7]、丝瓜、苦瓜、西瓜[18]；此外，还有藜科植物Chenopodium amaranticolor[3]、杏树[19]。
目前该病毒主要分布在德国、英国、印度、日本、韩国等国家，近年来，因从CGMMV流行的韩国、日本等国引进带病毒的种苗，使德我国北京、辽宁、河北和广西部分地区陆续有报道CGMMV的发生和危害情况。2005年辽宁省盖州市西瓜染病面积达333hm2，其中13 hm2绝收[20]。
CGMMV有多种传播方式 [1，6，16]，包括种子调运、汁液、植物间接触、农事操作、病株残体及含病株残体的土壤、河水、啮齿动物(如兔子、小白鼠等)的粪便、被污染的包装容器、灌溉水、栽培营养液、用作肥料的牛粪、菟丝子；黄瓜叶甲是可能的传播介体；但桃蚜不传毒，棉蚜也不传毒，被侵染瓠子、葫芦的根际土壤中并没有发现介体真菌。CGMMV远距离传播的主要侵染源是带毒种子。
CGMMV侵染植物之后，所产生的症状因寄主、环境条件以及株系的不同而有明显差异[1，8，9，11,17]，一般会使葫芦科作物的植株生长缓慢、矮化，结果延迟，甚至严重的导致不育。黄瓜、甜瓜、西瓜、瓠瓜等都是CGMMV的重要寄主，不同的病毒株系在不同瓜类作物上发病时，会引致不同的症状，掌握CGMMV在作物上引起的症状特性可以用于早期诊断。
黄瓜CGMMV典型株系(英国株系)为害黄瓜时，最初黄瓜新叶出现黄色小斑点，后逐渐发展成斑驳、花叶和浓绿泡状突起，叶片畸形；有时黄色小斑点沿叶脉扩展成星状，或脉间褪色，叶脉呈绿带状，植株往往矮化，果实上的症状不很明显[21]。但日本黄瓜株系却能导致病果出现严重的斑驳、浓绿色瘤状突起，形成畸形瓜，植株严重矮化旧[22]。也有些亚洲黄瓜品种的叶片并不出现症状，却造成产量下降。奥古巴花叶株系则使黄瓜叶片产生鲜黄的斑驳、稍畸形，病株稍矮化，病果上出现黄色或银色条纹和小斑点，高温下尤为突出[21]。
甜瓜受害枝蔓的新叶出现黄斑，但随着叶片的老化，症状逐渐减轻；成株侧枝的叶片呈现不整形或星状黄化叶，生长后期顶部叶片有时产生大型黄色轮斑。幼果有绿色花纹，后期为绿色斑，或在绿色斑中央再出现灰白色斑[23]。
西瓜CGMMV西瓜株系引起西瓜幼叶产生不规则的淡绿色或淡黄色花斑，继而绿色部分突起，叶面凹凸不平，病叶老化后症状逐渐减退，植株矮化；如在坐果期或坐果后不久受侵染，则果实表面出现浓绿色、略圆的斑纹，有时病斑中央产生坏死点；果实成熟时变为暗褐色，内部呈现空洞、腐烂[24]，果梗有褐色坏死条纹。
瓠瓜病叶为花叶，有绿色突起，脉间黄化呈叶脉绿带状；植株上部叶片变小、黄化，下部叶片边缘波浪状，叶脉皱缩，叶片畸形；未成熟果实出现轻微斑驳，绿色部分稍突起，成熟后症状消失，果梗坏死[25]。
在电镜下，CGMMV病毒呈长杆状，长度约300 nm，直径为18nm，无包膜[26]，其长杆状结构是由一个螺旋23A，半径20A，RNA位于距中心40A处，一个螺旋由49个亚单位或3个转角组成。
CGMMV是理化性质很稳定的一种病毒，尤其是在黄瓜汁液中，所有病毒株系都表现为极其稳定。CGMMV的致死温度：典型株系为90℃10 min[27]，西瓜和Yodo株系为90～100℃10 min，印度C株系为86～88℃10 min；稀释终点：典型株系为106，西瓜株系为107；体外保毒期：室温下为240 d以上，0℃时可达数年[28]。在盐贮藏的条件下，果实内的病毒经536 d后还有活力，甚至通过动物消化道之后仍然有致病性。在一20℃的条件下，CGMMV病毒仍能存活，一旦在适宜的条件，还能继续传播并蔓延扩大。在田间一旦发病，如果未能进行特殊的杀灭处理，其病株残体中的病毒可存活多年，即便是将病根埋在土壤里多年以上，CGMMV病毒仍然保持较强的侵染能力。
鉴于CGMMV的危害日趋严重，因此做好该病害的预防和控制刻不容缓。当然这也是十分艰巨的任务。其中加强检测是重要的措施之一。世界各国均相当重视并制定了相应的检疫措施，各国科学家也于1995、1998和2000年分别在中国台湾、荷兰和美国召开了国际研讨会，探讨CGMMV及相关病毒的鉴定、检测、防治及病毒基因组结构和功能的研究。VGMMV为我国进境植物检疫的危险性有害生物，寄主范围广、传播途径多、适生性强，进口植物种苗携带该病毒的风险性很大，伴随着我国进出境贸易的高速增长，传人我国并危害流行的可能性极大[29]。基于对该病毒的奉献评估，我国已将CGMMV列入2006年新公布的全国农业植物检疫性有害生物名单中。由于该病害在世界范围内广泛分布并普遍发生，所以对于该病害的检测及防治尤为重要。防治方法主要以抗病育种为主，伴随着抗病研究的不断发展，检测手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法[30]等。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言3
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.2 载体和宿主菌 3
1.3抗原制备蛋白原核表达3
1.3.1自动诱导法3
1.3.2蛋白纯化Ni柱纯化3
1.4免疫老鼠3
1.5融合小鼠的选择及效价测定4
1.5.1方法一：酶联免疫吸附分析（ELISA96孔板）4
1.5.2方法二：酶联免疫吸附分析（硝酸纤维素膜）4
1.6 杂交瘤细胞的制备 4
1.6.1 骨髓瘤细胞SP2/0的复苏及培养 4
1.6.2 饲养细胞的制备 5
1.6.3 免疫脾细胞的制备 5
1.6.4 细胞融合 5
1.6.5 融合细胞的培养 5
1.7 检测抗体是否可以检测植株内病毒 6
1.7.1 SDS－PAGE电泳6
1.7.3 转膜 6
1.7.3 免疫反应6
1.7.4 凝胶图象分析7
2 结果与分析 7
2．1 原核表达CGMMVN 7
2．2 选择融合小鼠 7
3 讨论 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
8
致谢8
参考文献9
黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的筛选
引言
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottlemosaic virus，CGMMV)是烟草花叶病毒属(To—bamovirus)葫芦科的重要病毒之一,给葫芦科农作物的生产造成严重危害。CGMWV在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋州等多个国家和地区广泛分布，CGMMV由Ainsworth首次记述[1]，主要分布在希腊(克里特岛)[2]、罗马尼亚[3]、中国台湾[4]、巴西(Sao Francisco地区)[5]、前苏联[6]、日本[7]、伊朗[8]、丹麦[9]、印度(Delhi) [10]、芬兰[11]、德国[12]、英国[13]、沙特阿拉伯[14]、韩国[15]、以色列[16]、波兰[17]。CGMMV的自然寄主主要为葫芦科作物，包括黄瓜[3]、葫芦[4]、甜瓜[7]、丝瓜、苦瓜、西瓜[18]；此外，还有藜科植物Chenopodium amaranticolor[3]、杏树[19]。
目前该病毒主要分布在德国、英国、印度、日本、韩国等国家，近年来，因从CGMMV流行的韩国、日本等国引进带病毒的种苗，使德我国北京、辽宁、河北和广西部分地区陆续有报道CGMMV的发生和危害情况。2005年辽宁省盖州市西瓜染病面积达333hm2，其中13 hm2绝收[20]。
CGMMV有多种传播方式 [1，6，16]，包括种子调运、汁液、植物间接触、农事操作、病株残体及含病株残体的土壤、河水、啮齿动物(如兔子、小白鼠等)的粪便、被污染的包装容器、灌溉水、栽培营养液、用作肥料的牛粪、菟丝子；黄瓜叶甲是可能的传播介体；但桃蚜不传毒，棉蚜也不传毒，被侵染瓠子、葫芦的根际土壤中并没有发现介体真菌。CGMMV远距离传播的主要侵染源是带毒种子。
CGMMV侵染植物之后，所产生的症状因寄主、环境条件以及株系的不同而有明显差异[1，8，9，11,17]，一般会使葫芦科作物的植株生长缓慢、矮化，结果延迟，甚至严重的导致不育。黄瓜、甜瓜、西瓜、瓠瓜等都是CGMMV的重要寄主，不同的病毒株系在不同瓜类作物上发病时，会引致不同的症状，掌握CGMMV在作物上引起的症状特性可以用于早期诊断。
黄瓜CGMMV典型株系(英国株系)为害黄瓜时，最初黄瓜新叶出现黄色小斑点，后逐渐发展成斑驳、花叶和浓绿泡状突起，叶片畸形；有时黄色小斑点沿叶脉扩展成星状，或脉间褪色，叶脉呈绿带状，植株往往矮化，果实上的症状不很明显[21]。但日本黄瓜株系却能导致病果出现严重的斑驳、浓绿色瘤状突起，形成畸形瓜，植株严重矮化旧[22]。也有些亚洲黄瓜品种的叶片并不出现症状，却造成产量下降。奥古巴花叶株系则使黄瓜叶片产生鲜黄的斑驳、稍畸形，病株稍矮化，病果上出现黄色或银色条纹和小斑点，高温下尤为突出[21]。
甜瓜受害枝蔓的新叶出现黄斑，但随着叶片的老化，症状逐渐减轻；成株侧枝的叶片呈现不整形或星状黄化叶，生长后期顶部叶片有时产生大型黄色轮斑。幼果有绿色花纹，后期为绿色斑，或在绿色斑中央再出现灰白色斑[23]。
西瓜CGMMV西瓜株系引起西瓜幼叶产生不规则的淡绿色或淡黄色花斑，继而绿色部分突起，叶面凹凸不平，病叶老化后症状逐渐减退，植株矮化；如在坐果期或坐果后不久受侵染，则果实表面出现浓绿色、略圆的斑纹，有时病斑中央产生坏死点；果实成熟时变为暗褐色，内部呈现空洞、腐烂[24]，果梗有褐色坏死条纹。
瓠瓜病叶为花叶，有绿色突起，脉间黄化呈叶脉绿带状；植株上部叶片变小、黄化，下部叶片边缘波浪状，叶脉皱缩，叶片畸形；未成熟果实出现轻微斑驳，绿色部分稍突起，成熟后症状消失，果梗坏死[25]。
在电镜下，CGMMV病毒呈长杆状，长度约300 nm，直径为18nm，无包膜[26]，其长杆状结构是由一个螺旋23A，半径20A，RNA位于距中心40A处，一个螺旋由49个亚单位或3个转角组成。
CGMMV是理化性质很稳定的一种病毒，尤其是在黄瓜汁液中，所有病毒株系都表现为极其稳定。CGMMV的致死温度：典型株系为90℃10 min[27]，西瓜和Yodo株系为90～100℃10 min，印度C株系为86～88℃10 min；稀释终点：典型株系为106，西瓜株系为107；体外保毒期：室温下为240 d以上，0℃时可达数年[28]。在盐贮藏的条件下，果实内的病毒经536 d后还有活力，甚至通过动物消化道之后仍然有致病性。在一20℃的条件下，CGMMV病毒仍能存活，一旦在适宜的条件，还能继续传播并蔓延扩大。在田间一旦发病，如果未能进行特殊的杀灭处理，其病株残体中的病毒可存活多年，即便是将病根埋在土壤里多年以上，CGMMV病毒仍然保持较强的侵染能力。
鉴于CGMMV的危害日趋严重，因此做好该病害的预防和控制刻不容缓。当然这也是十分艰巨的任务。其中加强检测是重要的措施之一。世界各国均相当重视并制定了相应的检疫措施，各国科学家也于1995、1998和2000年分别在中国台湾、荷兰和美国召开了国际研讨会，探讨CGMMV及相关病毒的鉴定、检测、防治及病毒基因组结构和功能的研究。VGMMV为我国进境植物检疫的危险性有害生物，寄主范围广、传播途径多、适生性强，进口植物种苗携带该病毒的风险性很大，伴随着我国进出境贸易的高速增长，传人我国并危害流行的可能性极大[29]。基于对该病毒的奉献评估，我国已将CGMMV列入2006年新公布的全国农业植物检疫性有害生物名单中。由于该病害在世界范围内广泛分布并普遍发生，所以对于该病害的检测及防治尤为重要。防治方法主要以抗病育种为主，伴随着抗病研究的不断发展，检测手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法[30]等。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/324.html
