酵母双杂交技术筛选与番茄免疫受体蛋白sw5b上cc结构域互作的宿主蛋白因子
番茄斑萎病毒（TSWV）是一种可系统侵染番茄、辣椒、烟草、心叶烟、百日草、莴苣等农作物的危害农产品的重要病毒。Sw-5b是植株抗TSWV的抗病基因，并已经证实抗病基因Sw-5b上cc结构域与植物的抗性表达有关。在蛋白质与蛋白质互作的研究方法中，酵母双杂交方便、灵敏度高并且高效，所以本实验就是采用这种方法进行筛选互作的因子。酵母双杂交是一种非常有效的分子生物学技术可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因，它利用酵母遗传学方法在真核细胞体内研究蛋白质之间相用。本实验利用酵母双杂交技术对与Sw-5b上cc结构域的互作因子进行筛选，进而研究抗性基因Sw-5b上cc结构域参与植物抗番茄斑萎病毒的机制原理。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
实验方法2
1.CC表达载体的构建2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2．1目的载体的回收2
1.2. 2目的片段的扩增与回收3
1.2. 3目的片段和载体酶切并回收3
1.2. 4目的片段和载体的连接和转化4
1.2. 5菌落PCR并提取阳性菌株的质粒4
1.2．6 PCR验证4
1.2．7扩增并送测分析4
2.转化Y2HGold酵母菌株 5
2.1酵母感受态细胞的制备 5
2.2转化酵母感受态 5
3.双杂交文库筛选 5
3.1材料 5
3.2方法 6
3.2．1与本氏烟的酵母文库融合 6
3.2．2涂板 6
结果7
1．1样品检测7
1．2序列分析7
2.转化酵母结果7
3.1共转验证结果 7
3.2共转验证结果分析 8
3.2.1共转验证过程中质粒发生丢失9
3.2.2同一个酵母菌落中含有多种质粒9
3.2.3实验材料与操作过程的问题10
3.2．4改进方法10
致谢11 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
参考文献12
图1 阳性菌落质粒 PCR扩增结果7
图2与文库融合后的菌株在四缺板上的生长情况8
图3 CC与互作基因共转酵母结果8
图 4 共转验证过程中质粒 PCR验证 9
图 5 10个单菌落酵母质粒序列同源性分析9
酵母双杂交技术筛选与番茄免疫受体蛋白Sw5b上CC结构域互作的宿主蛋白因子
植物保护学生 刘清红
引言
近年来，由于生产工具的农业生产结构的改变以及全球粮食作物贸易的扩大，导致各种病虫害在全球传播蔓延危害。由于农业产业结构发生巨大改变，番茄斑萎病毒（TSWV）随着虫媒介体蓟马进入我国，并对我国的大部分烟草种植区带来了严重的生产危害[1]。在前人的研究中，酵母双杂交在病毒学上的研究应用方面已经有显著效果，并且在研究蛋白质互作领域也有一定的成效。研究抗性基因sw5b上cc结构域的某个因子参与植物抗番茄斑萎病毒的机制原理，有利于进一步防治番茄斑萎病毒危害作物为育种[34]和转基因提供理论基础。培育抗性品种是防治番茄斑萎病毒的一种有效的防治措施。
番茄斑萎病毒(TSWV)属于布尼亚病毒科(Bunuyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)，其中番茄斑萎病毒属是布尼亚病毒科中唯一一个可以侵染植物的属，是Tospovirus内发现的第一个病毒—番茄斑萎病毒命名该属属名[5]。1944年，我国的第一例番茄斑萎病毒是由国内的研究员魏景超在成都发现的。经过研究者的不断研究和论证，已经明确了Sw5b是番茄斑萎病毒的抗性基因[68]。Sw5b是抗番茄斑萎病病毒的抗性基因，这个研究结果为后续的蛋白质互作研究提供了重要的理论依据 [911]。
酵母双杂交体系又名相互作用陷阱(lnteraction trap)，它是由Fields在研究真核基因转录调控中提出并初步建立 [12]。鉴于人们对酵母转录因子GAI4的认识水平达到一定水平，才建立了较为完整的系统。完整的酵母转录因子GAI4可分为2个结构域，一个是编码DNABD的片段，另一个编码AD基因，这两个结构域在结构上可以分开并且功能上也相互独立，只有当两者靠近结合时才能激活GAI4。将编码BDDNA的基因与待研究蛋白构建在同一个载体，编码AD的基因与已知蛋白构建在同一个载体，将两个载体进行共转验证。如果已知蛋白和研究蛋白之间存在相互作用，能够形成蛋白蛋白复合物,使GAL4 的2个结构域AD和BD相互接近, 这个连接好的整体与基因上游的报告因子结合，激活转录因子并启动转录,使下游的基因转录表达。相反,如果两个蛋白之间不存在相互作用,那么BD与AD就不能接近, 不能形成完整的酵母转录因子GAI4，最终无法启动转录表达。本实验利用Ade、His、Leu、Trp四种氨基酸的合成情况进行判断这两个基因是否发生互作。将相互作用中的已知蛋白进行检测,就能够找出研究蛋白与之作用的因子，可对它们之间作用的机制进行研究。酵母双杂技术在病毒蛋白和宿主蛋白的研究上已取得一定的成果，并在医学上也有一定的应用[13]。
一、实验方法
1．CC表达载体的构建
1．1 材料
1．1．1 菌株、CC片段和载体
大肠杆菌（ Escherichia coli）DH5α菌株来源于本实验室，保存在80℃冰箱；CC片段由特异性引物CCF／CCR以P2300Sw5b为模版扩增得到；克隆载体pGBKT7由本实验室保存，保存在20℃冰箱。
1．1．2 生化及分子生物学试剂
T4 DNA Ligase、Prime Star酶从TaKaRa公司采购； Taq DNA 聚合酶、dNTPs均来源于 Sangon Biotech公司；Trans 2K plus DNA Marker 来源于全式金生物科技有限公司；凝胶回收纯化试剂盒来自上海捷倍思公司；实验所需要的的限制性内切酶来自TaKaRa公司和NEB公司。
1．2 方法
1.2.1 目的载体的回收
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
实验方法2
1.CC表达载体的构建2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2．1目的载体的回收2
1.2. 2目的片段的扩增与回收3
1.2. 3目的片段和载体酶切并回收3
1.2. 4目的片段和载体的连接和转化4
1.2. 5菌落PCR并提取阳性菌株的质粒4
1.2．6 PCR验证4
1.2．7扩增并送测分析4
2.转化Y2HGold酵母菌株 5
2.1酵母感受态细胞的制备 5
2.2转化酵母感受态 5
3.双杂交文库筛选 5
3.1材料 5
3.2方法 6
3.2．1与本氏烟的酵母文库融合 6
3.2．2涂板 6
结果7
1．1样品检测7
1．2序列分析7
2.转化酵母结果7
3.1共转验证结果 7
3.2共转验证结果分析 8
3.2.1共转验证过程中质粒发生丢失9
3.2.2同一个酵母菌落中含有多种质粒9
3.2.3实验材料与操作过程的问题10
3.2．4改进方法10
致谢11 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
参考文献12
图1 阳性菌落质粒 PCR扩增结果7
图2与文库融合后的菌株在四缺板上的生长情况8
图3 CC与互作基因共转酵母结果8
图 4 共转验证过程中质粒 PCR验证 9
图 5 10个单菌落酵母质粒序列同源性分析9
酵母双杂交技术筛选与番茄免疫受体蛋白Sw5b上CC结构域互作的宿主蛋白因子
植物保护学生 刘清红
引言
近年来，由于生产工具的农业生产结构的改变以及全球粮食作物贸易的扩大，导致各种病虫害在全球传播蔓延危害。由于农业产业结构发生巨大改变，番茄斑萎病毒（TSWV）随着虫媒介体蓟马进入我国，并对我国的大部分烟草种植区带来了严重的生产危害[1]。在前人的研究中，酵母双杂交在病毒学上的研究应用方面已经有显著效果，并且在研究蛋白质互作领域也有一定的成效。研究抗性基因sw5b上cc结构域的某个因子参与植物抗番茄斑萎病毒的机制原理，有利于进一步防治番茄斑萎病毒危害作物为育种[34]和转基因提供理论基础。培育抗性品种是防治番茄斑萎病毒的一种有效的防治措施。
番茄斑萎病毒(TSWV)属于布尼亚病毒科(Bunuyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)，其中番茄斑萎病毒属是布尼亚病毒科中唯一一个可以侵染植物的属，是Tospovirus内发现的第一个病毒—番茄斑萎病毒命名该属属名[5]。1944年，我国的第一例番茄斑萎病毒是由国内的研究员魏景超在成都发现的。经过研究者的不断研究和论证，已经明确了Sw5b是番茄斑萎病毒的抗性基因[68]。Sw5b是抗番茄斑萎病病毒的抗性基因，这个研究结果为后续的蛋白质互作研究提供了重要的理论依据 [911]。
酵母双杂交体系又名相互作用陷阱(lnteraction trap)，它是由Fields在研究真核基因转录调控中提出并初步建立 [12]。鉴于人们对酵母转录因子GAI4的认识水平达到一定水平，才建立了较为完整的系统。完整的酵母转录因子GAI4可分为2个结构域，一个是编码DNABD的片段，另一个编码AD基因，这两个结构域在结构上可以分开并且功能上也相互独立，只有当两者靠近结合时才能激活GAI4。将编码BDDNA的基因与待研究蛋白构建在同一个载体，编码AD的基因与已知蛋白构建在同一个载体，将两个载体进行共转验证。如果已知蛋白和研究蛋白之间存在相互作用，能够形成蛋白蛋白复合物,使GAL4 的2个结构域AD和BD相互接近, 这个连接好的整体与基因上游的报告因子结合，激活转录因子并启动转录,使下游的基因转录表达。相反,如果两个蛋白之间不存在相互作用,那么BD与AD就不能接近, 不能形成完整的酵母转录因子GAI4，最终无法启动转录表达。本实验利用Ade、His、Leu、Trp四种氨基酸的合成情况进行判断这两个基因是否发生互作。将相互作用中的已知蛋白进行检测,就能够找出研究蛋白与之作用的因子，可对它们之间作用的机制进行研究。酵母双杂技术在病毒蛋白和宿主蛋白的研究上已取得一定的成果，并在医学上也有一定的应用[13]。
一、实验方法
1．CC表达载体的构建
1．1 材料
1．1．1 菌株、CC片段和载体
大肠杆菌（ Escherichia coli）DH5α菌株来源于本实验室，保存在80℃冰箱；CC片段由特异性引物CCF／CCR以P2300Sw5b为模版扩增得到；克隆载体pGBKT7由本实验室保存，保存在20℃冰箱。
1．1．2 生化及分子生物学试剂
T4 DNA Ligase、Prime Star酶从TaKaRa公司采购； Taq DNA 聚合酶、dNTPs均来源于 Sangon Biotech公司；Trans 2K plus DNA Marker 来源于全式金生物科技有限公司；凝胶回收纯化试剂盒来自上海捷倍思公司；实验所需要的的限制性内切酶来自TaKaRa公司和NEB公司。
1．2 方法
1.2.1 目的载体的回收
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