与番茄斑萎病毒核衣壳蛋白n互作的寄主因子筛选
番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）寄主范围广，感染TSWV的植物多为系统性侵染，植株矮化，叶片皱缩且不对称生长，叶片上可见坏死环斑或不规则的坏死区，严重时整个叶片甚至整个植株坏死呈萎蔫状。前期研究发现瞬时表达TSWV编码的核衣壳蛋白（N）可导致寄主产生类似病毒侵染的系统性坏死症状。为深入探究TSWV导致植物产生系统性坏死症状的机制，本实验以TSWV N及其导致细胞死亡的关键区域N-N?46C?82为诱饵，利用酵母双杂交的方法筛选本氏烟（Nicotiana benthamiana）cDNA文库以获得与二者互作的蛋白。经过多次筛选，TSWV N暂未筛到阳性克隆；TSWV N-N?46C?82共筛到3个阳性克隆，测序分析后均为Nicotiana tabacum F-box protein FBW2-like，推测N-N?46C?82可能与寄主F-box类蛋白互作从而干扰其调节功能进而导致坏死症状。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株、质粒、目的片段、文库2
1.1.2 培养基2
1.1.3 生化及分子生物学试剂2
1.2 方法 2
1.2.1 质粒的提取3
1.2.2 目的片段的回收3
1.2.3 目的片段和载体酶切与回收3
1.2.4 目的片段和载体的连接和转化4
1.2.5 菌落PCR并提取阳性菌株的质粒4
1.2.6 PCR验证、扩增、测序分析4
1.2.7 酵母感受态细胞的制备4
1.2.8 诱饵质粒转化到酵母细胞5
1.2.9 文库杂交筛选阳性克隆5
1.2.10 猎物蛋白质粒提取5
1.2.11 文库质粒和诱饵质粒共转化到酵母细胞验证5
2 结果与分析5
2.1 重组诱饵蛋白载体6
2.2 载体及诱饵蛋白自激活性检验6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
2.3 文库筛选结果6
2.4 酵母共转化验证8
3 讨论9
3.1 酵母双杂交系统9
3.2 共转化验证中对照的设立9
3.3 文库筛选结果分析9
3.4 存在的问题及解决措施9
3.4.1 TSWV N可形成多聚体结构9
3.4.2 培养基选择压力10
3.4.3 实验方案中需注意的问题10
3.5 后续研究计划10
致谢10
参考文献11
图1 NN?46C?82的扩增6
图2 菌落PCR验证结果6
图3 pGBKT7NN?46C?82筛库结果在QDO/X培养基生长情况7
图4 文库质粒菌落PCR验证结果7
图5 共转化验证QDO/X培养基生长情况8
图6 共转化验证结果示意图8
表1 13种可能与pGBKT7NN?46C?82互作的寄主因子8
与番茄斑萎病毒核衣壳蛋白N互作的寄主因子筛选
引言
引言
TSWV是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的典型成员，属于植物多分体负义链RNA病毒。1915年TSWV首次发现于澳大利亚，其后在世界各地广泛传播，造成巨大的经济损失，其在2011年列出的世界危害最大的十种病毒中名列第二[1]。
TSWV寄主范围十分广泛，可侵染84个科1000多种植物，其中茄科、葫芦科、菊科和豆科植物受害较为严重[2]。感染TSWV的植物多为系统性侵染，植株矮化，叶片皱缩形成不对称生长，叶片上可见坏死环斑或不规则的坏死区，严重时整个叶片甚至整个植株坏死呈萎蔫状。TSWV粒体呈近球形，有包膜，病毒粒体中含有病毒的核衣壳蛋白复合体，由核衣壳蛋白N、基因组RNA和少数几个拷贝的复制酶（RNA dependent RNA polymerase, RdRp）组装而成。病毒基因组为三分体单链RNA，根据其分子量大小分别命名为L RNA、M RNA 和S RNA。其中，L RNA长约9 kb，通过负义链编码一个开放阅读框即RdRp。M RNA为双义RNA，正义链编码移动蛋白NSm，反义链编码糖蛋白Gn和Gc。S RNA也是双义RNA，正义链编码RNA沉默抑制子NSs，反义链编码核衣壳蛋白N[3]。
截至目前，关于TSWV产生系统性坏死症状机制的研究还不多。大学分子植物病毒实验室前期研究中，以马铃薯 X 病毒（Potato virus X, PVX）为载体在本氏烟中瞬时表达TSWV编码的核衣壳蛋白N可产生类似于病毒侵染所造成的系统性坏死症状，故将N确定为病毒导致系统性坏死症状的决定因子。本实验在前期研究基础上展开，利用酵母双杂交技术，筛选与TSWV N及其致死重要区段NN?46C?82互作的寄主靶标因子，对揭示TSWV诱导植物产生系统性坏死的致病分子机制具有重要的科学意义。经过多次筛选，TSWV N因其自身可形成多聚体结构，暂时未筛到阳性克隆；TSWV N致死重要区段NN?46C?82共筛到3个阳性克隆，经测序分析后寄主因子均为Nicotiana tabacum Fbox protein FBW2like，故推测其可能与寄主Fbox类蛋白互作从而干扰其调节功能进而导致坏死症状。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株、质粒、目的片段、文库
大肠杆菌DH5α菌株、Y2H Gold酵母菌株；质粒pGBKT7、pGADT7、pGBKT753、pGADT7T、pGBKT7N；目的片段NN?46C?82由特异性引物P2175和P2097以表达载体p2300N为模版扩增得到；本氏烟cDNA文库为实验室购置，80℃保存。
1．1．2 培养基
SD/Trp
SD/Leu
SD/Leu/Trp(DDO)
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株、质粒、目的片段、文库2
1.1.2 培养基2
1.1.3 生化及分子生物学试剂2
1.2 方法 2
1.2.1 质粒的提取3
1.2.2 目的片段的回收3
1.2.3 目的片段和载体酶切与回收3
1.2.4 目的片段和载体的连接和转化4
1.2.5 菌落PCR并提取阳性菌株的质粒4
1.2.6 PCR验证、扩增、测序分析4
1.2.7 酵母感受态细胞的制备4
1.2.8 诱饵质粒转化到酵母细胞5
1.2.9 文库杂交筛选阳性克隆5
1.2.10 猎物蛋白质粒提取5
1.2.11 文库质粒和诱饵质粒共转化到酵母细胞验证5
2 结果与分析5
2.1 重组诱饵蛋白载体6
2.2 载体及诱饵蛋白自激活性检验6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
2.3 文库筛选结果6
2.4 酵母共转化验证8
3 讨论9
3.1 酵母双杂交系统9
3.2 共转化验证中对照的设立9
3.3 文库筛选结果分析9
3.4 存在的问题及解决措施9
3.4.1 TSWV N可形成多聚体结构9
3.4.2 培养基选择压力10
3.4.3 实验方案中需注意的问题10
3.5 后续研究计划10
致谢10
参考文献11
图1 NN?46C?82的扩增6
图2 菌落PCR验证结果6
图3 pGBKT7NN?46C?82筛库结果在QDO/X培养基生长情况7
图4 文库质粒菌落PCR验证结果7
图5 共转化验证QDO/X培养基生长情况8
图6 共转化验证结果示意图8
表1 13种可能与pGBKT7NN?46C?82互作的寄主因子8
与番茄斑萎病毒核衣壳蛋白N互作的寄主因子筛选
引言
引言
TSWV是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的典型成员，属于植物多分体负义链RNA病毒。1915年TSWV首次发现于澳大利亚，其后在世界各地广泛传播，造成巨大的经济损失，其在2011年列出的世界危害最大的十种病毒中名列第二[1]。
TSWV寄主范围十分广泛，可侵染84个科1000多种植物，其中茄科、葫芦科、菊科和豆科植物受害较为严重[2]。感染TSWV的植物多为系统性侵染，植株矮化，叶片皱缩形成不对称生长，叶片上可见坏死环斑或不规则的坏死区，严重时整个叶片甚至整个植株坏死呈萎蔫状。TSWV粒体呈近球形，有包膜，病毒粒体中含有病毒的核衣壳蛋白复合体，由核衣壳蛋白N、基因组RNA和少数几个拷贝的复制酶（RNA dependent RNA polymerase, RdRp）组装而成。病毒基因组为三分体单链RNA，根据其分子量大小分别命名为L RNA、M RNA 和S RNA。其中，L RNA长约9 kb，通过负义链编码一个开放阅读框即RdRp。M RNA为双义RNA，正义链编码移动蛋白NSm，反义链编码糖蛋白Gn和Gc。S RNA也是双义RNA，正义链编码RNA沉默抑制子NSs，反义链编码核衣壳蛋白N[3]。
截至目前，关于TSWV产生系统性坏死症状机制的研究还不多。大学分子植物病毒实验室前期研究中，以马铃薯 X 病毒（Potato virus X, PVX）为载体在本氏烟中瞬时表达TSWV编码的核衣壳蛋白N可产生类似于病毒侵染所造成的系统性坏死症状，故将N确定为病毒导致系统性坏死症状的决定因子。本实验在前期研究基础上展开，利用酵母双杂交技术，筛选与TSWV N及其致死重要区段NN?46C?82互作的寄主靶标因子，对揭示TSWV诱导植物产生系统性坏死的致病分子机制具有重要的科学意义。经过多次筛选，TSWV N因其自身可形成多聚体结构，暂时未筛到阳性克隆；TSWV N致死重要区段NN?46C?82共筛到3个阳性克隆，经测序分析后寄主因子均为Nicotiana tabacum Fbox protein FBW2like，故推测其可能与寄主Fbox类蛋白互作从而干扰其调节功能进而导致坏死症状。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株、质粒、目的片段、文库
大肠杆菌DH5α菌株、Y2H Gold酵母菌株；质粒pGBKT7、pGADT7、pGBKT753、pGADT7T、pGBKT7N；目的片段NN?46C?82由特异性引物P2175和P2097以表达载体p2300N为模版扩增得到；本氏烟cDNA文库为实验室购置，80℃保存。
1．1．2 培养基
SD/Trp
SD/Leu
SD/Leu/Trp(DDO)
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