转基因棉花对不同棉铃虫种群的抗虫性检测
转基因抗虫棉花因其对棉铃虫良好的防治作用和对环境的友好性已经在全球广泛应用了近20年，当前靶标害虫的抗性问题日趋严重，如何有效防控成了当前生产实际中急待解决的问题。本实验以转Bt基因棉花和两种表达昆虫激素代谢相关基因dsRNA的新型转基因棉花为对象，评价它们对不种棉铃虫种群的抗虫性,并观察了对棉铃虫幼虫生长发育和化蛹情况的影响。结果表明，双价Bt基因抗虫棉(Bollgard Ⅱ)的抗虫性较好，对抗性种群也具有较好的控制作用,抗虫棉对幼虫生长发育的影响可以持续整个幼虫期并降低化蛹率；新型转基因棉花的抗虫性不明显，与转Bt基因棉叠加后抗虫性有提高，说明RNA干扰应用于转基因抗虫棉的技术发展还未成熟，与能够应用于生产实践有一定差距。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1供试棉铃虫 2
1.2供试转基因棉花3
1.3 转基因棉花抗虫性检测方法 3
1.4 棉铃虫幼虫期的生长发育情况调查方法 3
1.5 棉铃虫蛹期的生长发育情况调查方法 3
2 结果与分析 3
2.1 转基因棉花对棉铃虫的抗虫性检测 3
2.2 转基因棉花对棉铃虫幼虫后续生长发育的影响 5
2.3 转基因棉花对棉铃虫化蛹情况的影响 9
3 讨论 9
3.1 RNA干扰技术介导的转基因棉花的发展前景9
3.2 Bt棉与RNA干扰技术介导的新型转基因棉花的抗虫性比较10
3.3 各品种转基因棉花对不同品系棉铃虫的抗虫性差异原因分析10
致谢 11
参考文献 12
图1棉铃虫敏感品系SCD幼虫在不同棉花品种上平均体重的变化曲线 7
图2棉铃虫Cry1Ac隐性抗性品系CAD幼虫在不同棉花品种上平均体重的变化曲线7
图3棉铃虫Cry2Ab抗性品系An2Ab幼虫在不同棉花品种上平均体重的变化曲线8
图4棉铃虫Cry1Ac显性抗性品系AY2幼虫在不同棉花品种上平均体重的变化曲线8< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
br /> 图5不同棉铃虫品系在不同棉花品种上的化蛹率9
图6不同棉铃虫品系在不同棉花品种上的平均蛹重9
表1不同品种棉花对不同品系棉铃虫的抗虫性检测5
表2棉铃虫不同品系幼虫在不同棉花品种上的平均体重6 转基因棉花对不同棉铃虫种群的抗虫性检测
引言
转基因棉花首次于1996年在美国和澳大利亚等国家被商业化推广种植，其中包括Bt基因抗虫棉花和抗除草剂棉花。1996年转基因棉花的全球种植面积只有不足100万hm2，但截至2011年已突破2500万hm2（James,2011）。2014年，中国转基因抗虫棉花的种植面积到达了390万hm2，种植率从2013年的90%增加到2014年的93%（James,2014）。最新数据显示1997年~2013年农民从Bt棉花获得的经济收益为162亿美元，仅2013年一年就达到了16亿美元（James,2014）。以Bt棉为代表的转基因抗虫棉花的大规模种植有效地控制了棉铃虫的为害，减少了化学杀虫剂的使用，得到了广泛的生产应用，并取得了巨大的经济和生态效益。
但是转基因棉花在被广泛应用的同时也带来一些问题，如Bt棉的长期和高密度种植会导致棉铃虫对Bt毒素产生抗性，目前生产上推广的Bt抗虫棉以单价转 Bt 基因棉居多，其主要表达的转 Bt 杀虫基因只有一种。但是转Bt基因单价棉抗虫谱窄且抗性比较单一，易对棉铃虫产生抗性。1996年，第一批Bt棉在澳大利亚被商业化种植后，因达不到有害生物治理的期望效果而被弃用（常雪艳，2006；Roush R T,1997）。较转Bt基因单价棉而言，利用基因叠加策略通过表达两种或两种以上不同的毒素基因形成的转基因双价或多价抗虫棉更能有效地阻碍棉铃虫Bt抗性的发展。如同时表达Cry1Ac和Cry2Ab毒素的双价转Bt基因棉（Bollgard II）就已在全球范围内获得了广泛的应用。当然双价棉的持续使用也可能造成一定的威胁，目前已经有报道显示棉铃虫对Cry1Ac和Cry2Ab产生了不对称的交互抗性（Tabashnik等，2009）。为了阻碍Bt抗性的进一步发展和转Bt棉的可持续利用，有必要运用科学合理的新技术寻找并使用新基因来发掘新型转基因抗虫棉品种，研究其应用价值与发展前景，以延缓Bt抗性和转Bt棉的可持续利用。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）可以显著影响靶标基因的有效表达，因此利物植物表达与昆虫特定基因相匹配的dsRNA的RNA干扰技术以控制昆虫成为可能。它是将相应的dsRNA(doublestranded RNA)或者siRNA(small interference RNA)导入植物中，这些dsRNA或siRNA与目标mRNA特异结合，专一地识别靶标基因，抑制昆虫目标基因的表达，使昆虫的生长发育受阻或致死。已经有报道称，此项技术可以有效地抑制害虫基因的表达从而达到一定的抗虫效果（Zhu et al. 2012）。此外还可以考虑将现有的Bt棉花与RNAi进行协作或许能够有效地延缓棉铃虫对Bt棉花的抗性，可选用抑制棉铃虫等害虫生长发育的关键基因作为RNAi靶标基因，培育能够同时表达靶标基因dsRNA的新型转Bt基因棉花，达到减缓Bt抗性的发展速度、丰富Bt抗性治理策略，从而有利于Bt棉花的持续使用和棉铃虫的防治的目的。
昆虫蜕皮是由激素介导调控的一系列蜕皮调节转录因子和效应基因表达及相互作用的级联反应过程，这一过程可概括为3个阶段：即促前胸腺激素（Prothoracicotropic hormone,PTTH）介导的蜕皮激素合成阶段、蜕皮激素调控转录因子和效应基因表达阶段、脱去旧表皮以及新表皮鞣化（黑化和硬化）阶段（赵小凡，2007）。目前，PTTH介导蜕皮激素合成及蜕皮激素调控转录因子表达方面的研究较多，机理阐述也较为详细。因此可尝试通过RNAi技术构建能表达棉铃虫靶标基因(PTTH5和JHBP1)双链RNA的新型转基因抗虫棉，抑制促前胸腺激素和保幼激素的合成与代谢，干扰其正常功能，有效影响棉铃虫的生长、发育及繁殖，从而控制棉铃虫的种群数量。
本实验利用常规非抗虫棉（泗棉3号）品种作为对照，检测并比较了6种转基因棉花材料对4个不同抗性背景品系的棉铃虫的抗虫效果，以及转Bt基因棉花对棉铃虫幼虫生长发育和化蛹的影响，以全面评价不同转基因品种的抗虫效果。
1 材料与方法
供试棉铃虫
SCD：室内敏感品系，是20 世纪70 年代源自科特迪瓦（Cote D’Ivoire）的敏感品系，2001 年由拜耳公司提供。在室内不接触任何杀虫剂或Bt毒素的条件下用人工饲料连续饲养(Yang et al. 2009)。
CAD：Cry1Ac隐性抗性品系，通过基因渗透将室内抗性品系GYBT 的钙粘蛋白突变基因r1 整合进敏感品系SCD，形成近等基因系CAD。与SCD 相比，CAD 对Cry1Ac产生400 多倍抗性(Yang et al. 2009)。
AY2：Cry1Ac显性抗性品系，相比SCD品系对Cry1Ac有1200倍抗性。
An2Ab：Cry2Ab抗性品系，与敏感品系相比，对Cry2Ab有134倍抗性，对Cry 1Ac有21倍的交互抗性。
供试转基因棉花
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1供试棉铃虫 2
1.2供试转基因棉花3
1.3 转基因棉花抗虫性检测方法 3
1.4 棉铃虫幼虫期的生长发育情况调查方法 3
1.5 棉铃虫蛹期的生长发育情况调查方法 3
2 结果与分析 3
2.1 转基因棉花对棉铃虫的抗虫性检测 3
2.2 转基因棉花对棉铃虫幼虫后续生长发育的影响 5
2.3 转基因棉花对棉铃虫化蛹情况的影响 9
3 讨论 9
3.1 RNA干扰技术介导的转基因棉花的发展前景9
3.2 Bt棉与RNA干扰技术介导的新型转基因棉花的抗虫性比较10
3.3 各品种转基因棉花对不同品系棉铃虫的抗虫性差异原因分析10
致谢 11
参考文献 12
图1棉铃虫敏感品系SCD幼虫在不同棉花品种上平均体重的变化曲线 7
图2棉铃虫Cry1Ac隐性抗性品系CAD幼虫在不同棉花品种上平均体重的变化曲线7
图3棉铃虫Cry2Ab抗性品系An2Ab幼虫在不同棉花品种上平均体重的变化曲线8
图4棉铃虫Cry1Ac显性抗性品系AY2幼虫在不同棉花品种上平均体重的变化曲线8< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
br /> 图5不同棉铃虫品系在不同棉花品种上的化蛹率9
图6不同棉铃虫品系在不同棉花品种上的平均蛹重9
表1不同品种棉花对不同品系棉铃虫的抗虫性检测5
表2棉铃虫不同品系幼虫在不同棉花品种上的平均体重6 转基因棉花对不同棉铃虫种群的抗虫性检测
引言
转基因棉花首次于1996年在美国和澳大利亚等国家被商业化推广种植，其中包括Bt基因抗虫棉花和抗除草剂棉花。1996年转基因棉花的全球种植面积只有不足100万hm2，但截至2011年已突破2500万hm2（James,2011）。2014年，中国转基因抗虫棉花的种植面积到达了390万hm2，种植率从2013年的90%增加到2014年的93%（James,2014）。最新数据显示1997年~2013年农民从Bt棉花获得的经济收益为162亿美元，仅2013年一年就达到了16亿美元（James,2014）。以Bt棉为代表的转基因抗虫棉花的大规模种植有效地控制了棉铃虫的为害，减少了化学杀虫剂的使用，得到了广泛的生产应用，并取得了巨大的经济和生态效益。
但是转基因棉花在被广泛应用的同时也带来一些问题，如Bt棉的长期和高密度种植会导致棉铃虫对Bt毒素产生抗性，目前生产上推广的Bt抗虫棉以单价转 Bt 基因棉居多，其主要表达的转 Bt 杀虫基因只有一种。但是转Bt基因单价棉抗虫谱窄且抗性比较单一，易对棉铃虫产生抗性。1996年，第一批Bt棉在澳大利亚被商业化种植后，因达不到有害生物治理的期望效果而被弃用（常雪艳，2006；Roush R T,1997）。较转Bt基因单价棉而言，利用基因叠加策略通过表达两种或两种以上不同的毒素基因形成的转基因双价或多价抗虫棉更能有效地阻碍棉铃虫Bt抗性的发展。如同时表达Cry1Ac和Cry2Ab毒素的双价转Bt基因棉（Bollgard II）就已在全球范围内获得了广泛的应用。当然双价棉的持续使用也可能造成一定的威胁，目前已经有报道显示棉铃虫对Cry1Ac和Cry2Ab产生了不对称的交互抗性（Tabashnik等，2009）。为了阻碍Bt抗性的进一步发展和转Bt棉的可持续利用，有必要运用科学合理的新技术寻找并使用新基因来发掘新型转基因抗虫棉品种，研究其应用价值与发展前景，以延缓Bt抗性和转Bt棉的可持续利用。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）可以显著影响靶标基因的有效表达，因此利物植物表达与昆虫特定基因相匹配的dsRNA的RNA干扰技术以控制昆虫成为可能。它是将相应的dsRNA(doublestranded RNA)或者siRNA(small interference RNA)导入植物中，这些dsRNA或siRNA与目标mRNA特异结合，专一地识别靶标基因，抑制昆虫目标基因的表达，使昆虫的生长发育受阻或致死。已经有报道称，此项技术可以有效地抑制害虫基因的表达从而达到一定的抗虫效果（Zhu et al. 2012）。此外还可以考虑将现有的Bt棉花与RNAi进行协作或许能够有效地延缓棉铃虫对Bt棉花的抗性，可选用抑制棉铃虫等害虫生长发育的关键基因作为RNAi靶标基因，培育能够同时表达靶标基因dsRNA的新型转Bt基因棉花，达到减缓Bt抗性的发展速度、丰富Bt抗性治理策略，从而有利于Bt棉花的持续使用和棉铃虫的防治的目的。
昆虫蜕皮是由激素介导调控的一系列蜕皮调节转录因子和效应基因表达及相互作用的级联反应过程，这一过程可概括为3个阶段：即促前胸腺激素（Prothoracicotropic hormone,PTTH）介导的蜕皮激素合成阶段、蜕皮激素调控转录因子和效应基因表达阶段、脱去旧表皮以及新表皮鞣化（黑化和硬化）阶段（赵小凡，2007）。目前，PTTH介导蜕皮激素合成及蜕皮激素调控转录因子表达方面的研究较多，机理阐述也较为详细。因此可尝试通过RNAi技术构建能表达棉铃虫靶标基因(PTTH5和JHBP1)双链RNA的新型转基因抗虫棉，抑制促前胸腺激素和保幼激素的合成与代谢，干扰其正常功能，有效影响棉铃虫的生长、发育及繁殖，从而控制棉铃虫的种群数量。
本实验利用常规非抗虫棉（泗棉3号）品种作为对照，检测并比较了6种转基因棉花材料对4个不同抗性背景品系的棉铃虫的抗虫效果，以及转Bt基因棉花对棉铃虫幼虫生长发育和化蛹的影响，以全面评价不同转基因品种的抗虫效果。
1 材料与方法
供试棉铃虫
SCD：室内敏感品系，是20 世纪70 年代源自科特迪瓦（Cote D’Ivoire）的敏感品系，2001 年由拜耳公司提供。在室内不接触任何杀虫剂或Bt毒素的条件下用人工饲料连续饲养(Yang et al. 2009)。
CAD：Cry1Ac隐性抗性品系，通过基因渗透将室内抗性品系GYBT 的钙粘蛋白突变基因r1 整合进敏感品系SCD，形成近等基因系CAD。与SCD 相比，CAD 对Cry1Ac产生400 多倍抗性(Yang et al. 2009)。
AY2：Cry1Ac显性抗性品系，相比SCD品系对Cry1Ac有1200倍抗性。
An2Ab：Cry2Ab抗性品系，与敏感品系相比，对Cry2Ab有134倍抗性，对Cry 1Ac有21倍的交互抗性。
供试转基因棉花
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