xoc strain gd41 tale基因的筛选
水稻是中国第一大粮食作物，其产量占中国粮食产量的40%左右。由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，Xoc）引起的水稻细菌性条斑病（bacterial leaf streak，BLS）已发展成为水稻的第四大病害。研究表明Xoc的毒力主要依靠III型分泌系统所分泌的效应物。类转录激活因子（transcription activator-like effectors, Tales）是来自黄单胞菌属的一类III型效应因子。为了解水稻细菌性条斑病菌菌株GD41中含有Tale家族基因的情况，本研究在已构建的GD41 Tale基因组文库的基础上，通过Southern杂交分析，得到20个独立克隆。这20个克隆中至少含有19个不同的Tale家族基因。本研究基本明确了菌株GD41基因组中Tale基因的数量，并为进一步研究菌株GD41中Tale基因的功能奠定基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1供试菌株与质粒 3
1.2培养基 3
1.3所用抗生素浓度 3
1.4主要试剂 3
1.5 PCR扩增DNA片段 3
1.5.1 菌落PCR反应体系 3
1.5.2 菌落PCR反应程序 4
1.6 tal基因BamHI片段阳性克隆获取 4
1.6.1 热转化 4
1.6.2质粒DNA的提取 4
1.6.3 BamHI酶酶切质粒DNA 4
1.6.4 探针的标记及定量标记反应效率 5
1.6.5 菌落原位杂交 6
1.7 阳性克隆的验证 — Southern印迹杂交 8
2 结果与分析 9
2.1探针的获得 9
2.2获得含有tal基因片段的阳性克隆 9
2.3菌落原位杂交分析菌株GD41文库克隆中的tal家族基因 10
2.4酶切Southern杂交分析菌株GD41文库克隆中的tal家族基因 11< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
br /> 2.5 Xoc GD41 菌中Tale 数量的估计 11
3 讨论 12
致谢 14
参考文献： 15
Xoc strain GD41 Tale基因的筛选
引言
引言
水稻是中国第一大粮食作物，其产量占中国粮食产量的40%左右。由稻黄单胞菌稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的水稻白叶枯病（bacterial leaf blight， BLB）是水稻 3 大病害（稻瘟病、白叶枯病和稻纹枯病）之一，由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，Xoc）引起的水稻细菌性条斑病（bacterial leaf streak，BLS）已发展成为水稻的第四大病害[1]。
在植物病原黄单胞菌中存在一类avr基因家族,命名为avrBs3/pthA基因家族。这类基因家族成员在大多数黄单胞菌中都存在,其蛋白和细胞核中转录因子有相似结构,属于类转录激活因子(transcription activatorlike effector，Tale),也被称为tal效应分子[2]。Tale是病原菌在侵染植物后通过Ⅲ型泌出系统( T3SS) 泌出后，进入寄主细胞后起转录因子作用，调控寄主基因表达，操控水稻的抗( 感) 病性（Resistance /Susceptibility）的基因。因此克隆Xoc中的Tale基因，研究其数量及功能对培育抗病品种具有重要意义。
针对Tale基因的研究已历经数年，迄今为止, 已陆续在黄单胞菌属及其致病变型中发现将近千个Tale。研究发现, 在部分Ralstonia solanacearum中存在Tale的同源蛋白, 这些蛋白在致病菌侵染植物时也是通过III型分泌系统转运到宿主细胞中, 但是否具有转录激活因子的作用尚不清楚[3]。发现的第一个Tale 基因是辣椒斑点病菌（X. campestris pv. Vesicatoria,Xcv）中的avr Bs3（此菌中仅1个），随后在棉花细菌性角斑病菌（X. axonopodis pv. Malvacearum,Xcm）（此菌中6—8个）、柑橘溃疡病菌（X. citri subpv. citri，Xcc）（此菌中1—4个）和稻黄单胞菌（此菌中8—30个）中发现。这提示，长期人工驯化的栽培水稻，促使稻黄单胞菌更多的Tale基因产生[1]。
Tale是由一个中央DNA结合区、一个核定位信号和两侧的N末端的分泌信号及C末端的转录激活域序列组成。其中N末端的转移结构域在Tale通过III型分泌系统转移到植物体内的过程中发挥作用，C末端的核定位信号和酸性转录激活结构域在Tale转运到细胞核并行使转录激活功能的过程中具有重要作用[3]。其中的DNA结合区域介导Tale与特异序列的DNA结合，包括33 34个氨基酸的多个重复，每个重复中的第1213个氨基酸是高度变异的，两个氨基酸组成一个重复可变双残基(repeat variable diresidue，RVD)，RVD的组成、顺序决定了与目标核苷酸序列的识别或结合[4]。RVD序列的多态性是Tales功能多样性的基础，这对不同地理区域的不同水稻品种致病力的维持是有益的[5]。
tal家族基因广泛存在于植物病原黄单胞菌中，这一家族的发现主要是因为其avirulence(avr)/pathogenicity(pth)的功能，无毒性(avr)体现在其能激发寄主或非寄主特异的HR反应,一种细胞编程死亡的，伴随着活性氧的进发、胼胝质的积累和防卫基因的表达,对细菌自身生长是不利的，因此，在寄主R基因的选择压力下，tal基因发生了变异和进化。若寄主中没有与之匹配的R基因，则表现为毒性,毒性（pth）主要体现在它是病原菌适应性、侵袭力或是持久性而所必需的[6]。
tal基因家族中已知的具有无毒活性基因有avrBs3、avrBs4、avrBs5、avrXa7、avrXa10、avrXa27[6]。水稻白叶枯病菌中已鉴定出来对于致病性具有贡献的主要tal基因家族成员有avrXa7、pthXo1、pthXo2和pthXo3.其中，pthXo1是PXO99A的主要致病因子[21]，pthXo2是PXO71菌株的主要毒性基因，pthXo3存在于PXO61中[6]。
水稻白叶枯病菌PXO99A中有19个tal基因，tal4就是其中一个。已有研究通过测定tal4基因缺失突变菌株在寄主水稻上的毒力，对温度、盐、酸碱等胁迫的反应以及对杀菌剂的敏感性来挖掘tal4基因的功能。PXO99A中的tal4基因的缺失对病原菌的毒力没有明显影响。但是tal4基因缺失，导致水稻白叶枯病菌对噻唑类杀菌剂噻枯唑的敏感性增强，这说明tal4基因在病原菌对杀菌剂抗药性中起一定的作用。该研究中的突变是针对tal4基因构建的，且tal4编码基因可以恢复PXO99Δtal4改变了的表型，由此可见，PXO99Δtal4 对噻枯唑的敏感性改变和tal基因有关[11]。
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1供试菌株与质粒 3
1.2培养基 3
1.3所用抗生素浓度 3
1.4主要试剂 3
1.5 PCR扩增DNA片段 3
1.5.1 菌落PCR反应体系 3
1.5.2 菌落PCR反应程序 4
1.6 tal基因BamHI片段阳性克隆获取 4
1.6.1 热转化 4
1.6.2质粒DNA的提取 4
1.6.3 BamHI酶酶切质粒DNA 4
1.6.4 探针的标记及定量标记反应效率 5
1.6.5 菌落原位杂交 6
1.7 阳性克隆的验证 — Southern印迹杂交 8
2 结果与分析 9
2.1探针的获得 9
2.2获得含有tal基因片段的阳性克隆 9
2.3菌落原位杂交分析菌株GD41文库克隆中的tal家族基因 10
2.4酶切Southern杂交分析菌株GD41文库克隆中的tal家族基因 11< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
br /> 2.5 Xoc GD41 菌中Tale 数量的估计 11
3 讨论 12
致谢 14
参考文献： 15
Xoc strain GD41 Tale基因的筛选
引言
引言
水稻是中国第一大粮食作物，其产量占中国粮食产量的40%左右。由稻黄单胞菌稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的水稻白叶枯病（bacterial leaf blight， BLB）是水稻 3 大病害（稻瘟病、白叶枯病和稻纹枯病）之一，由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，Xoc）引起的水稻细菌性条斑病（bacterial leaf streak，BLS）已发展成为水稻的第四大病害[1]。
在植物病原黄单胞菌中存在一类avr基因家族,命名为avrBs3/pthA基因家族。这类基因家族成员在大多数黄单胞菌中都存在,其蛋白和细胞核中转录因子有相似结构,属于类转录激活因子(transcription activatorlike effector，Tale),也被称为tal效应分子[2]。Tale是病原菌在侵染植物后通过Ⅲ型泌出系统( T3SS) 泌出后，进入寄主细胞后起转录因子作用，调控寄主基因表达，操控水稻的抗( 感) 病性（Resistance /Susceptibility）的基因。因此克隆Xoc中的Tale基因，研究其数量及功能对培育抗病品种具有重要意义。
针对Tale基因的研究已历经数年，迄今为止, 已陆续在黄单胞菌属及其致病变型中发现将近千个Tale。研究发现, 在部分Ralstonia solanacearum中存在Tale的同源蛋白, 这些蛋白在致病菌侵染植物时也是通过III型分泌系统转运到宿主细胞中, 但是否具有转录激活因子的作用尚不清楚[3]。发现的第一个Tale 基因是辣椒斑点病菌（X. campestris pv. Vesicatoria,Xcv）中的avr Bs3（此菌中仅1个），随后在棉花细菌性角斑病菌（X. axonopodis pv. Malvacearum,Xcm）（此菌中6—8个）、柑橘溃疡病菌（X. citri subpv. citri，Xcc）（此菌中1—4个）和稻黄单胞菌（此菌中8—30个）中发现。这提示，长期人工驯化的栽培水稻，促使稻黄单胞菌更多的Tale基因产生[1]。
Tale是由一个中央DNA结合区、一个核定位信号和两侧的N末端的分泌信号及C末端的转录激活域序列组成。其中N末端的转移结构域在Tale通过III型分泌系统转移到植物体内的过程中发挥作用，C末端的核定位信号和酸性转录激活结构域在Tale转运到细胞核并行使转录激活功能的过程中具有重要作用[3]。其中的DNA结合区域介导Tale与特异序列的DNA结合，包括33 34个氨基酸的多个重复，每个重复中的第1213个氨基酸是高度变异的，两个氨基酸组成一个重复可变双残基(repeat variable diresidue，RVD)，RVD的组成、顺序决定了与目标核苷酸序列的识别或结合[4]。RVD序列的多态性是Tales功能多样性的基础，这对不同地理区域的不同水稻品种致病力的维持是有益的[5]。
tal家族基因广泛存在于植物病原黄单胞菌中，这一家族的发现主要是因为其avirulence(avr)/pathogenicity(pth)的功能，无毒性(avr)体现在其能激发寄主或非寄主特异的HR反应,一种细胞编程死亡的，伴随着活性氧的进发、胼胝质的积累和防卫基因的表达,对细菌自身生长是不利的，因此，在寄主R基因的选择压力下，tal基因发生了变异和进化。若寄主中没有与之匹配的R基因，则表现为毒性,毒性（pth）主要体现在它是病原菌适应性、侵袭力或是持久性而所必需的[6]。
tal基因家族中已知的具有无毒活性基因有avrBs3、avrBs4、avrBs5、avrXa7、avrXa10、avrXa27[6]。水稻白叶枯病菌中已鉴定出来对于致病性具有贡献的主要tal基因家族成员有avrXa7、pthXo1、pthXo2和pthXo3.其中，pthXo1是PXO99A的主要致病因子[21]，pthXo2是PXO71菌株的主要毒性基因，pthXo3存在于PXO61中[6]。
水稻白叶枯病菌PXO99A中有19个tal基因，tal4就是其中一个。已有研究通过测定tal4基因缺失突变菌株在寄主水稻上的毒力，对温度、盐、酸碱等胁迫的反应以及对杀菌剂的敏感性来挖掘tal4基因的功能。PXO99A中的tal4基因的缺失对病原菌的毒力没有明显影响。但是tal4基因缺失，导致水稻白叶枯病菌对噻唑类杀菌剂噻枯唑的敏感性增强，这说明tal4基因在病原菌对杀菌剂抗药性中起一定的作用。该研究中的突变是针对tal4基因构建的，且tal4编码基因可以恢复PXO99Δtal4改变了的表型，由此可见，PXO99Δtal4 对噻枯唑的敏感性改变和tal基因有关[11]。
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