中华按蚊多线染色体的制备及dna扩增与纯化
本研究制备了中华按蚊四龄幼虫的多线染色体玻片并利用相差显微镜对染色体影像做图，将所得染色体图像与前人发表的结果进行比较，发现本研究制备的染色体带型更加清晰，为进一步完善中华按蚊的染色体图谱打下了基础。通过PCR定向克隆中华按蚊总DNA片段，并利用荧光进行DNA探针标记，为进一步的染色体荧光原位杂交打下基础。本研究为探讨我国不同地理区域的中华按蚊习性在生态习性和疟疾能力传播方面的遗传差异提供了理论依据。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2中华按蚊染色体玻片的制备4
1.2.1唾液腺的获取及染色体释放4
1.2.2固定及脱水5
1.3中华按蚊多线染色体的成像分析5
1. 4中华按蚊总DNA提取5
1. 5DNA的扩增和纯化5
1.5.1 引物的设计5
1.5.2 PCR扩增5
1.5.3 PCR产物的鉴定（琼脂糖凝胶电泳）6
1.5.4 PCR产物回收6
2结果与分析6
2.1 中华按蚊唾液腺获取结果7
2.2 中华按蚊基因组DNA浓度测定结果7
2.3 DNA扩增和纯化的结果7
2.4 多线染色体制备结果8
3讨论 8
致谢9
参考文献10
图1 获取中华按蚊唾液腺7
图2 中华按蚊多线染色体影像图8
图3 叶炳辉等制作的中华按蚊多线染色体图8
图4 徐秀芬等制作的郑州中华按蚊多线染色体图9
图5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图9
表1 中华按蚊基因组DNA浓度测定结果7
表2 探针纯化后浓度测定结果8
中华按蚊多线染色体的制备及DNA扩增与纯化
引言
引言
疟疾是严重危害人类健康的重要虫媒传染病,世界卫生组织把疟疾、艾滋病 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
和结核一起列为全球三大公共卫生问题[1]。截至2011年，黄淮流域和南部地区是我国主要疟疾发生区，主要为输入性疟疾[2]。按蚊(Anopheles) 是传播人体疟原虫的主要媒介,在我国已知的56种按蚊中, 其中4种是传播疟疾的主要媒介，即嗜人按蚊(An. anthropophagus)、中华按蚊(An. sinensis)、微小按蚊(An. minimus) 和大劣按蚊 (An. dirus）[3]。防蚊灭蚊是防治疟疾的重要环节。近年来，由于随着务工、留学、旅游等人口流动现象增多，我国输入性恶性疟疾的病例也逐渐增多，疟疾传播有回暖趋势。
中华按蚊是节肢动物门、有颚亚门、六足总纲、昆虫纲、有翅亚纲、双翅目、长角亚目、蚊科、按蚊亚科、按蚊属的一种,是我国广大平原地区传播疟疾和马来丝虫病的重要媒介，但在不同地理区域，其生态习性和疟疾传播能力有一定差异。大量的研究表明，按蚊染色体的重组能影响蚊媒传播疾病的机会、能力甚至决定蚊虫对杀虫剂的敏感程度及其生态习性，故而研究其染色体具有重要的医学意义。
按蚊各组织内存在着高质量的多线染色体，多线染色体是巨大的长绳状的细胞间期染色体，具有稳定的、典型的染色体带谱[4]。几乎所有的按蚊都有两对体染色体和一对性染色体，由于Y染色体其异染色质特性没有多线染色体，多线染色体又被进一步划分为五条染色体臂：X，2R, 2L，3R和3L。利用这一特点，按蚊染色体图谱是传统上有效区分近似种、复合体内的小种甚至不同地理区域品系的必不可少的分类手段。
最早的按蚊多线染色体图谱是由Coluzzi等绘制的冈比亚按蚊复合体的唾液腺多线染色体图谱，Sharakhov等对按蚊多线染色体图谱进行归纳总结，目前为止已累计达50种[49 ]。Sharma 首次在印度发表了中华按蚊4龄幼虫的唾液腺多线染色体的全图。[10]日本Kanda和Oguma亦曾发表过有关中华按蚊唾腺染色体的描述。[11、12]我国对中华按蚊多线染色体图谱的研究起步较国外较晚。叶炳辉等最早发表了南京中华按蚊染色体图谱，并比较了徐州和宜兴两地株的唾液腺染色体[3、13、14]。李本文等描述理论湖南长沙地区的中华按蚊染色体带纹[15]。徐秀芬描述了郑州和福建株洲中华按蚊唾液腺染色体图谱[16、17]。高分辨率的中华按蚊多线染色体图谱可以广泛应用于系统分类、生态遗传学、遗传防治等，同时染色体图谱还是物理图谱构建的基础，是基因测序和基因定位的基础框架。
多线染色体图谱的绘制方法有两种：手绘制图以及图像制图。大多早期的染色体图为绘成模式图，是以染色体的玻片标本为基础，将多线染色体的粗细及带纹特征尽量按照其原有的形状进行描绘而画出的染色体图[18]。此法的优点是能清楚地识别带纹的深浅、粗细和确切存在的数目，但因其与实物的形态差异太大，应用时很不方便。后来随着光学显微技术的迅速发展，具有高像素的染色体图像图逐渐取代了手绘图。
本毕业实习以中华按蚊四龄幼虫作为实验材料制备唾液腺多线染色体玻片以及获取和纯化其DNA片段，为构建高分辨率的中华按蚊多线染色体图谱和多线染色体的荧光原位杂交奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验采用中华按蚊上海株实验品系，本品系已在实验室条件下稳定养殖多年。本项目用的中华按蚊卵由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供。
挑取大的、四龄初期的中华按蚊幼虫固定在卡氏固定液中（甲醇：冰乙酸 = 3：1），储存在20℃冰箱中备用。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2中华按蚊染色体玻片的制备4
1.2.1唾液腺的获取及染色体释放4
1.2.2固定及脱水5
1.3中华按蚊多线染色体的成像分析5
1. 4中华按蚊总DNA提取5
1. 5DNA的扩增和纯化5
1.5.1 引物的设计5
1.5.2 PCR扩增5
1.5.3 PCR产物的鉴定（琼脂糖凝胶电泳）6
1.5.4 PCR产物回收6
2结果与分析6
2.1 中华按蚊唾液腺获取结果7
2.2 中华按蚊基因组DNA浓度测定结果7
2.3 DNA扩增和纯化的结果7
2.4 多线染色体制备结果8
3讨论 8
致谢9
参考文献10
图1 获取中华按蚊唾液腺7
图2 中华按蚊多线染色体影像图8
图3 叶炳辉等制作的中华按蚊多线染色体图8
图4 徐秀芬等制作的郑州中华按蚊多线染色体图9
图5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图9
表1 中华按蚊基因组DNA浓度测定结果7
表2 探针纯化后浓度测定结果8
中华按蚊多线染色体的制备及DNA扩增与纯化
引言
引言
疟疾是严重危害人类健康的重要虫媒传染病,世界卫生组织把疟疾、艾滋病 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
和结核一起列为全球三大公共卫生问题[1]。截至2011年，黄淮流域和南部地区是我国主要疟疾发生区，主要为输入性疟疾[2]。按蚊(Anopheles) 是传播人体疟原虫的主要媒介,在我国已知的56种按蚊中, 其中4种是传播疟疾的主要媒介，即嗜人按蚊(An. anthropophagus)、中华按蚊(An. sinensis)、微小按蚊(An. minimus) 和大劣按蚊 (An. dirus）[3]。防蚊灭蚊是防治疟疾的重要环节。近年来，由于随着务工、留学、旅游等人口流动现象增多，我国输入性恶性疟疾的病例也逐渐增多，疟疾传播有回暖趋势。
中华按蚊是节肢动物门、有颚亚门、六足总纲、昆虫纲、有翅亚纲、双翅目、长角亚目、蚊科、按蚊亚科、按蚊属的一种,是我国广大平原地区传播疟疾和马来丝虫病的重要媒介，但在不同地理区域，其生态习性和疟疾传播能力有一定差异。大量的研究表明，按蚊染色体的重组能影响蚊媒传播疾病的机会、能力甚至决定蚊虫对杀虫剂的敏感程度及其生态习性，故而研究其染色体具有重要的医学意义。
按蚊各组织内存在着高质量的多线染色体，多线染色体是巨大的长绳状的细胞间期染色体，具有稳定的、典型的染色体带谱[4]。几乎所有的按蚊都有两对体染色体和一对性染色体，由于Y染色体其异染色质特性没有多线染色体，多线染色体又被进一步划分为五条染色体臂：X，2R, 2L，3R和3L。利用这一特点，按蚊染色体图谱是传统上有效区分近似种、复合体内的小种甚至不同地理区域品系的必不可少的分类手段。
最早的按蚊多线染色体图谱是由Coluzzi等绘制的冈比亚按蚊复合体的唾液腺多线染色体图谱，Sharakhov等对按蚊多线染色体图谱进行归纳总结，目前为止已累计达50种[49 ]。Sharma 首次在印度发表了中华按蚊4龄幼虫的唾液腺多线染色体的全图。[10]日本Kanda和Oguma亦曾发表过有关中华按蚊唾腺染色体的描述。[11、12]我国对中华按蚊多线染色体图谱的研究起步较国外较晚。叶炳辉等最早发表了南京中华按蚊染色体图谱，并比较了徐州和宜兴两地株的唾液腺染色体[3、13、14]。李本文等描述理论湖南长沙地区的中华按蚊染色体带纹[15]。徐秀芬描述了郑州和福建株洲中华按蚊唾液腺染色体图谱[16、17]。高分辨率的中华按蚊多线染色体图谱可以广泛应用于系统分类、生态遗传学、遗传防治等，同时染色体图谱还是物理图谱构建的基础，是基因测序和基因定位的基础框架。
多线染色体图谱的绘制方法有两种：手绘制图以及图像制图。大多早期的染色体图为绘成模式图，是以染色体的玻片标本为基础，将多线染色体的粗细及带纹特征尽量按照其原有的形状进行描绘而画出的染色体图[18]。此法的优点是能清楚地识别带纹的深浅、粗细和确切存在的数目，但因其与实物的形态差异太大，应用时很不方便。后来随着光学显微技术的迅速发展，具有高像素的染色体图像图逐渐取代了手绘图。
本毕业实习以中华按蚊四龄幼虫作为实验材料制备唾液腺多线染色体玻片以及获取和纯化其DNA片段，为构建高分辨率的中华按蚊多线染色体图谱和多线染色体的荧光原位杂交奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验采用中华按蚊上海株实验品系，本品系已在实验室条件下稳定养殖多年。本项目用的中华按蚊卵由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供。
挑取大的、四龄初期的中华按蚊幼虫固定在卡氏固定液中（甲醇：冰乙酸 = 3：1），储存在20℃冰箱中备用。
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