一个水稻热激蛋白基因（oshsp20）的克隆及转基因株系构建
：水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，随着“温室效应”的不断加剧，高温已成为制约水稻生产重要的非生物胁迫之一。在前期工作中，利用蛋白组学技术，鉴定了一个与水稻种子萌发相关的热激蛋白基因（OsHsp20）。本课题通过PCR技术成功克隆了基因OsHsp20，该基因全长为723 bp，编码240个氨基酸，且只有一个开放阅读框（ORF）。组织表达分析表明，该基因在水稻穗部表达量显著高于其它组织；进一步通过农杆菌介导方法获得了转基因植株，为后期进一步研究该基因在种子萌发中的作用机理提供基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料 2
1.2 植物材料培养及处理2
1.3 OsHsp20的组织表达分析2
1.3.1 水稻总RNA的提取和cDNA第一链的合成2
1.3.2 Quantitative Realtime PCR分析3
1.4 OsHsp20的克隆3
1.4.1 OsHsp20的PCR扩增3
1.4.2 OsHsp20目的片段回收3
1.4.3 大肠杆菌感受态细胞的制备3
1.4.4 基因连接、热激转化、培养3
1.4.5 重组质粒的筛选与鉴定4
1.5 植物表达载体的构建与鉴定4
1.5.1 OsHsp20过量表达载体的构建4
1.5.2 OsHsp20干涉载体的构建4
1.5.3 转基因水稻的构建5
2 结果与分析6
2.1 OsHsp20的克隆6
2.2 OsHsp20序列分析7
2.3 OsHsp20氨基酸序列比较及系统进化树7
2.4 OsHsp20组织表达分析9
2.5 OsHsp20的转基因株系构建9
3 讨论 11
3.1 OsHsp20基因克隆11
3.2 OsHsp20基因表达分析11
3.3 OsHsp20基因
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
转基因载体构建11
致谢11
参考文献12
附录13
一个水稻热激蛋白基因（OsHsp20）的克隆及转基因株系构建
引言
引言
植物生活空间的自然条件总和称为植物环境，它包含许多不同的因素，如温度、水分、光照、气候、土壤情况、其他生物因子及人类的社会经济活动等。凡是对植物生长发育和生存不利的环境条件统称为逆境胁迫，包括生物和理化胁迫。其中，生物胁迫主要包括病虫害、杂草等，而理化胁迫主要有温度（高温、冻害、冷害）、水分（干旱和淹涝）、盐碱、农药化肥、环境污染等。植物在长时间的进化过程中，自身形成了一系列分子防御机制来应对各种不利的生长条件[1]。在生理学上，将植物对各种逆境因子的抵抗和忍耐能力称为植物抗逆性，简称抗性。
极端的生长环境常常会导致植物体内的蛋白失活，从而影响作物的产量和品质。因此，人们开始关注蛋白质是如何在逆境胁迫下保持正常的功能构象，以防止功能蛋白失活。以往研究表明，热激蛋白（heat shock protein, Hsp）是一类在抵抗逆境胁迫过程中起到重要作用的蛋白质分子[13]。热激蛋白作为分子伴侣，在正常的细胞中，它能够维持蛋白的功能结构，协助蛋白折叠、组装、运输和降解；而当植物受到胁迫时，它又能承担起协助蛋白复性、重新折叠、保护蛋白质和细胞膜稳定的功能[2]。提高Hsps基因表达量能够显著提高植物对逆境胁迫的耐受性[46]，但是它们的分子机制尚未清楚。
水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，同时也是单子叶植物中的模式生物。近年来，全球气候变暖，持续高温频繁出现，致使我国南方水稻种植区发生热害的频率加大，这极大影响了水稻产量[7]。Peng等[8]研究表明当水稻生长期间环境温度每上升1℃，产量将下降10%。可见，研究水稻耐高温胁迫分子机制，培育耐高温水稻品种具有重要意义。陈新海等研究表明热激蛋白在水稻抗高温胁迫中发挥着重要的保护作用[9]。至今，在水稻上仅有少量热激蛋白有过研究，如小热激蛋白（small Hsp）和Hsp100家族[8,10]，有关水稻热激蛋白作用机理有待进一步研究。
实验室前期工作中，通过蛋白组学技术成功鉴定到一个与水稻种子萌发相关的热激蛋白基因（OsHsp20）。本研究对该基因进行克隆，并进行生物信息学分析及组织表达分析，同时开展转基因载体构建工作，为进一步研究该基因在种子萌发过程中的作用机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
水稻粳稻品种（Oryza sativa L. spp. Japonica）韭菜青和中花11均由实验室保存提供。
1.2 植物材料培养及处理
水稻种子（韭菜青）用0.1% HgCl2消毒15 min，用自来水冲洗23次，放置30℃培养箱催芽至种子露白，然后将种子播于96孔板中，于人工气候培养箱（16 h光照/8 h黑暗，白天30℃夜晚26℃）中水培生长，营养液采用国际水稻所常规营养液配方（附录1）。待幼苗生长至3~4叶期时，取叶片样品，于液氮中速冻并保存于80℃冰箱。组织表达分析的韭菜青植株种植于大学江浦实验基地，于水稻成株孕穗时收集样品，包括根、茎、叶、节间和穗，同样液氮中速冻并保存于80℃冰箱。
1.3 OsHsp20组织表达分析
1.3.1 水稻总RNA的提取和cDNA第一链的合成
1.3.1.1 水稻总RNA的提取
参照Invitrogen公司提供的Trizol法提取水稻总RNA。
（1）称取0.1 g植物叶片，于研钵中快速用液氮研至粉末状。
（2）将粉末转入1.5 mL RNasefree离心管中，立即加入1 mL Trizol Reagent提取液，涡旋或用枪头吹吸数次，4 ℃、12000 rpm离心10 min。
（3）小心吸取上清至新的RNasefree离心管中，加入200 μL氯仿、200 μL苯酚，剧烈振荡混匀，室温静置3 min左右。
（4）4 ℃、12000 rpm离心10 min，取上清，加入500 μL异丙醇，充分混匀，静置10 min左右。
（5）4 ℃、12000 rpm离心10 min，弃上清，加入500 μL75%乙醇（DEPC水配置），剧烈涡旋。
（6）4 ℃、12000 rpm离心5 min，弃上清（尽量除尽乙醇）。
（7）重复步骤5、6，室温晾干沉淀。
（8）加3040 μLDEPC水溶解，1%琼脂糖凝胶电泳分析，进行浓度检测，符合要求后放置于80℃保存备用。
1.3.1.2 水稻cDNA第一链的合成
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料 2
1.2 植物材料培养及处理2
1.3 OsHsp20的组织表达分析2
1.3.1 水稻总RNA的提取和cDNA第一链的合成2
1.3.2 Quantitative Realtime PCR分析3
1.4 OsHsp20的克隆3
1.4.1 OsHsp20的PCR扩增3
1.4.2 OsHsp20目的片段回收3
1.4.3 大肠杆菌感受态细胞的制备3
1.4.4 基因连接、热激转化、培养3
1.4.5 重组质粒的筛选与鉴定4
1.5 植物表达载体的构建与鉴定4
1.5.1 OsHsp20过量表达载体的构建4
1.5.2 OsHsp20干涉载体的构建4
1.5.3 转基因水稻的构建5
2 结果与分析6
2.1 OsHsp20的克隆6
2.2 OsHsp20序列分析7
2.3 OsHsp20氨基酸序列比较及系统进化树7
2.4 OsHsp20组织表达分析9
2.5 OsHsp20的转基因株系构建9
3 讨论 11
3.1 OsHsp20基因克隆11
3.2 OsHsp20基因表达分析11
3.3 OsHsp20基因
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
转基因载体构建11
致谢11
参考文献12
附录13
一个水稻热激蛋白基因（OsHsp20）的克隆及转基因株系构建
引言
引言
植物生活空间的自然条件总和称为植物环境，它包含许多不同的因素，如温度、水分、光照、气候、土壤情况、其他生物因子及人类的社会经济活动等。凡是对植物生长发育和生存不利的环境条件统称为逆境胁迫，包括生物和理化胁迫。其中，生物胁迫主要包括病虫害、杂草等，而理化胁迫主要有温度（高温、冻害、冷害）、水分（干旱和淹涝）、盐碱、农药化肥、环境污染等。植物在长时间的进化过程中，自身形成了一系列分子防御机制来应对各种不利的生长条件[1]。在生理学上，将植物对各种逆境因子的抵抗和忍耐能力称为植物抗逆性，简称抗性。
极端的生长环境常常会导致植物体内的蛋白失活，从而影响作物的产量和品质。因此，人们开始关注蛋白质是如何在逆境胁迫下保持正常的功能构象，以防止功能蛋白失活。以往研究表明，热激蛋白（heat shock protein, Hsp）是一类在抵抗逆境胁迫过程中起到重要作用的蛋白质分子[13]。热激蛋白作为分子伴侣，在正常的细胞中，它能够维持蛋白的功能结构，协助蛋白折叠、组装、运输和降解；而当植物受到胁迫时，它又能承担起协助蛋白复性、重新折叠、保护蛋白质和细胞膜稳定的功能[2]。提高Hsps基因表达量能够显著提高植物对逆境胁迫的耐受性[46]，但是它们的分子机制尚未清楚。
水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，同时也是单子叶植物中的模式生物。近年来，全球气候变暖，持续高温频繁出现，致使我国南方水稻种植区发生热害的频率加大，这极大影响了水稻产量[7]。Peng等[8]研究表明当水稻生长期间环境温度每上升1℃，产量将下降10%。可见，研究水稻耐高温胁迫分子机制，培育耐高温水稻品种具有重要意义。陈新海等研究表明热激蛋白在水稻抗高温胁迫中发挥着重要的保护作用[9]。至今，在水稻上仅有少量热激蛋白有过研究，如小热激蛋白（small Hsp）和Hsp100家族[8,10]，有关水稻热激蛋白作用机理有待进一步研究。
实验室前期工作中，通过蛋白组学技术成功鉴定到一个与水稻种子萌发相关的热激蛋白基因（OsHsp20）。本研究对该基因进行克隆，并进行生物信息学分析及组织表达分析，同时开展转基因载体构建工作，为进一步研究该基因在种子萌发过程中的作用机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
水稻粳稻品种（Oryza sativa L. spp. Japonica）韭菜青和中花11均由实验室保存提供。
1.2 植物材料培养及处理
水稻种子（韭菜青）用0.1% HgCl2消毒15 min，用自来水冲洗23次，放置30℃培养箱催芽至种子露白，然后将种子播于96孔板中，于人工气候培养箱（16 h光照/8 h黑暗，白天30℃夜晚26℃）中水培生长，营养液采用国际水稻所常规营养液配方（附录1）。待幼苗生长至3~4叶期时，取叶片样品，于液氮中速冻并保存于80℃冰箱。组织表达分析的韭菜青植株种植于大学江浦实验基地，于水稻成株孕穗时收集样品，包括根、茎、叶、节间和穗，同样液氮中速冻并保存于80℃冰箱。
1.3 OsHsp20组织表达分析
1.3.1 水稻总RNA的提取和cDNA第一链的合成
1.3.1.1 水稻总RNA的提取
参照Invitrogen公司提供的Trizol法提取水稻总RNA。
（1）称取0.1 g植物叶片，于研钵中快速用液氮研至粉末状。
（2）将粉末转入1.5 mL RNasefree离心管中，立即加入1 mL Trizol Reagent提取液，涡旋或用枪头吹吸数次，4 ℃、12000 rpm离心10 min。
（3）小心吸取上清至新的RNasefree离心管中，加入200 μL氯仿、200 μL苯酚，剧烈振荡混匀，室温静置3 min左右。
（4）4 ℃、12000 rpm离心10 min，取上清，加入500 μL异丙醇，充分混匀，静置10 min左右。
（5）4 ℃、12000 rpm离心10 min，弃上清，加入500 μL75%乙醇（DEPC水配置），剧烈涡旋。
（6）4 ℃、12000 rpm离心5 min，弃上清（尽量除尽乙醇）。
（7）重复步骤5、6，室温晾干沉淀。
（8）加3040 μLDEPC水溶解，1%琼脂糖凝胶电泳分析，进行浓度检测，符合要求后放置于80℃保存备用。
1.3.1.2 水稻cDNA第一链的合成
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/624.html
