生防假单胞菌杀线虫活性物质的鉴定
本研究前期发现，生防假单胞菌（Pseudomonas protegens）Pf-5菌株对根结线虫具有致死活性。为了研究该生防菌对线虫的致死机理，本研究以模式线虫秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)为作用对象，开展相关研究工作。研究表明，Pf-5菌株对秀丽小杆线虫具有很强的致死活性。利用荧光蛋白GFP标记的Pf-5(gfp)菌株的观察结果表明，Pf-5菌株能定殖在线虫的口针和食道部位。我们进一步利用pK18mobsacB无标记载体，构建了Pf-5△fitD突变体。结果表明，Pf-5△fitD虽然也能定殖在线虫的口针和食道部位，但是杀线虫活性几乎完全丧失。不同浓度的菌体处理结果表明，Pf-5菌体浓度在107CFU/mL及以上时，都具有杀线虫活性，而Pf-5△fitD在相应处理浓度下，杀线虫活性几乎完全丧失。当菌体浓度在108CFU/mL时，Pf-5菌株处理6 h，线虫的死亡率接近100%，当处理时间为24 h时，线虫完全死亡。而Pf-5△fitD突变体在108CFU/mL时，各个时间段线虫的死亡率都只有10%左右。该研究表明，Pf-5菌株的杀线虫活性与fitD基因有关，为进一步的机理研究提供了研究材料。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1供试菌株与质粒 2
1.1.1供试菌株与质粒 2
1.1.2菌株的培养与保存 3
1.2培养基与抗生素 3
1.2.1培养基 3
1.2.2抗生素 3
1.3试验试剂与器材 3
1.3.1试验试剂 3
1.3.2试验器材 4
1.4供试线虫 4
2试验方法 4
2.1 FitD基因缺失突变体的构建 4
2.1.1引物的设计与合成 4
2.1.2pf5菌株基因组的提取 4
2.1.3PCR扩增FitD上、下游片段 4
2.1.4DNA片段的纯化回收 5
2.1.5连接和转化 5
2.2获取缺失突变体菌株 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
7
2.2.1Pf5的转化 7
2.2.3菌落PCR验证 7
2.3野生型和突变体标记GFP 7
2.4利用野生型和突变体处理秀丽小杆线虫 7
3结果与分析 8
3.1 FitD突变载体的构建 8
3.2 Pf5的FitD 缺失突变体的构建 8
3.3 GFP标记野生型pf5和pf5ΔFitD突变体 9
3.4 Pf5处理根结线虫 9
3.5 Pf5突变体在秀丽小杆线虫体内的定殖情况 9
3.6 Pf5突变型与野生型的杀线虫效果对比 10
4讨论 10
致谢 11
参考文献 11
生防假单胞菌杀线虫活性物质的鉴定
引言
引言
植物寄生线虫是一类两侧对称原体腔无脊椎动物，它能寄生在植物体内，危害寄主植物，引起植物病害，造成作物产量和质量上的损失，以及巨大的经济损失。全世界主要农作物每年因植物寄生线虫危害造成的损失高达1250亿美元，其危害超过细菌病害和病毒病害，仅次于真菌病害，同时植物寄生线虫加剧真菌和细菌侵染，是诱发植物病害的重要原因之一[1,2]。其中，植物根结线虫和孢囊线虫分布范围最广，对农作物生产造成的危害尤为严重[35]。化学药剂由于具有防效好，见效快的特点，一直是防治植物寄生线虫的主要方法，但同时也带来了一系列的副作用，如产生抗药性、破坏生态平衡以及造成环境污染等。因此，采用生物防治方法来治理线虫病害，符合现代可持续农业的发展要求[6]。常用于防治线虫的生物资源主要包括细菌、真菌、放线菌和原生动物等[7,8]。其中，生防细菌对植物寄生线虫的作用方式包括：直接寄生、影响线虫的生活行为、干扰线虫与寄主植物之间的识别、改变根系分泌物与线虫作用方式、产生拮抗物质抑制线虫卵的孵化、阻止幼虫的生长和直接杀死线虫等[911]。
生防假单胞菌(Pseudomonas spp.)作为植物根围促生细菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)研究领域的典型代表，具有高效利用种子和根系渗出物，快速生长繁殖，有效定殖在植物根际，产生多类活性代谢物质等优点，可有效防治由植物病原真菌、细菌和线虫等引起的土传病害，被作为植物病害生防菌得到广泛研究。部分菌株已经商业化应用于植物病害生物防治，如假单胞菌ESC10和A506等[12]。国内的铜绿假单胞菌M18和荧光假单胞菌2P24等也具有很好的生防效果[13,14]。此外，部分假单胞菌抗菌物质已在农药杀菌剂领域得到商业化的应用，如硝吡咯菌素（pyrrolnitrin，Prn）衍生出的拌种咯和咯菌腈[15]；我国自主研发的申嗪霉素，其主要成份吩嗪1羧酸（phenazine1carboxylic acid，PCA）产自M18菌株[13]。
假单胞菌(P. protegens) Pf5菌株，先前命名为荧光假单胞菌（P. fluorescens ）Pf5。该菌株分离自棉花根际土壤，对卵菌、真菌和细菌等引起的植物病害具有较好的防治效果。Pf5菌株全基因组已知，能遗传操作，是研究生防假单胞菌的模式菌株[16]。Pf5菌株能通过非核糖体途径合成多种活性物质，这些物质在其防治植物病害中起着重要作用。如2,4二乙酰基间苯三酚（2,4diacetylphloroglucinol, DAPG）具有抑制细菌、真菌和卵菌活性[16]，还能作为激发子诱导植物产生系统抗性（Induced systemic resistance，ISR)[17]；硝吡咯菌素对菌核病菌和丝核病菌具有较强的抑制活性[18]；藤黄绿脓菌素（Pyoluteorin, Plt）具有抑制卵菌和细菌的活性[19]；新鉴定的根菌素（Rhizoxin）和脂肽类物质（orfamideA）也具有抑制真菌的活性[2021]；挥发性抑菌物质氢氰酸（Hydrogen cyanide, HCN），有助于防治土传病害[16]。另外，Pf5菌株能产生两种嗜铁素Pyochelin和pyoverdine，这类物质能帮助其竞争铁元素抑制病原物生长[16]。
近期的研究结果表明，pf5菌株含有杀螟虫幼虫活性相关基因簇Fit。该菌株对苗圃的棉蚜（Aphis gossypii Glover）、烟芽夜蛾（Heliothis virescens）和小麦茅虫（Sitodiplosis mosellana）表现出有效口服致死活性。用每毫升仅含1000个假单胞菌细胞的悬浮液喷洒植物叶表面，足以杀死7080％的草地夜蛾（Spodoptera frugiperda?(J.E.Smmith)）和棉铃虫（Helicoverpa armigera Hubner）幼虫[22]。本课题组前期研究结果也表明，Pf5菌株对根结线虫（Meloidogyne incongnita）和秀丽小杆线虫(C.elegans)都具有很强的致死活性。但该菌株以及其Fit基因簇产物对昆虫以及线虫的作用机理还未知。本研究以生防菌Pf5以及其Fit基因簇为研究对象，以模式生物秀丽小杆线虫为作用对象。鉴定该菌株的杀线虫物质以及作用机理。研究为开发新型环保线虫生防药剂奠定理论和实践基础。
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1供试菌株与质粒 2
1.1.1供试菌株与质粒 2
1.1.2菌株的培养与保存 3
1.2培养基与抗生素 3
1.2.1培养基 3
1.2.2抗生素 3
1.3试验试剂与器材 3
1.3.1试验试剂 3
1.3.2试验器材 4
1.4供试线虫 4
2试验方法 4
2.1 FitD基因缺失突变体的构建 4
2.1.1引物的设计与合成 4
2.1.2pf5菌株基因组的提取 4
2.1.3PCR扩增FitD上、下游片段 4
2.1.4DNA片段的纯化回收 5
2.1.5连接和转化 5
2.2获取缺失突变体菌株 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
7
2.2.1Pf5的转化 7
2.2.3菌落PCR验证 7
2.3野生型和突变体标记GFP 7
2.4利用野生型和突变体处理秀丽小杆线虫 7
3结果与分析 8
3.1 FitD突变载体的构建 8
3.2 Pf5的FitD 缺失突变体的构建 8
3.3 GFP标记野生型pf5和pf5ΔFitD突变体 9
3.4 Pf5处理根结线虫 9
3.5 Pf5突变体在秀丽小杆线虫体内的定殖情况 9
3.6 Pf5突变型与野生型的杀线虫效果对比 10
4讨论 10
致谢 11
参考文献 11
生防假单胞菌杀线虫活性物质的鉴定
引言
引言
植物寄生线虫是一类两侧对称原体腔无脊椎动物，它能寄生在植物体内，危害寄主植物，引起植物病害，造成作物产量和质量上的损失，以及巨大的经济损失。全世界主要农作物每年因植物寄生线虫危害造成的损失高达1250亿美元，其危害超过细菌病害和病毒病害，仅次于真菌病害，同时植物寄生线虫加剧真菌和细菌侵染，是诱发植物病害的重要原因之一[1,2]。其中，植物根结线虫和孢囊线虫分布范围最广，对农作物生产造成的危害尤为严重[35]。化学药剂由于具有防效好，见效快的特点，一直是防治植物寄生线虫的主要方法，但同时也带来了一系列的副作用，如产生抗药性、破坏生态平衡以及造成环境污染等。因此，采用生物防治方法来治理线虫病害，符合现代可持续农业的发展要求[6]。常用于防治线虫的生物资源主要包括细菌、真菌、放线菌和原生动物等[7,8]。其中，生防细菌对植物寄生线虫的作用方式包括：直接寄生、影响线虫的生活行为、干扰线虫与寄主植物之间的识别、改变根系分泌物与线虫作用方式、产生拮抗物质抑制线虫卵的孵化、阻止幼虫的生长和直接杀死线虫等[911]。
生防假单胞菌(Pseudomonas spp.)作为植物根围促生细菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)研究领域的典型代表，具有高效利用种子和根系渗出物，快速生长繁殖，有效定殖在植物根际，产生多类活性代谢物质等优点，可有效防治由植物病原真菌、细菌和线虫等引起的土传病害，被作为植物病害生防菌得到广泛研究。部分菌株已经商业化应用于植物病害生物防治，如假单胞菌ESC10和A506等[12]。国内的铜绿假单胞菌M18和荧光假单胞菌2P24等也具有很好的生防效果[13,14]。此外，部分假单胞菌抗菌物质已在农药杀菌剂领域得到商业化的应用，如硝吡咯菌素（pyrrolnitrin，Prn）衍生出的拌种咯和咯菌腈[15]；我国自主研发的申嗪霉素，其主要成份吩嗪1羧酸（phenazine1carboxylic acid，PCA）产自M18菌株[13]。
假单胞菌(P. protegens) Pf5菌株，先前命名为荧光假单胞菌（P. fluorescens ）Pf5。该菌株分离自棉花根际土壤，对卵菌、真菌和细菌等引起的植物病害具有较好的防治效果。Pf5菌株全基因组已知，能遗传操作，是研究生防假单胞菌的模式菌株[16]。Pf5菌株能通过非核糖体途径合成多种活性物质，这些物质在其防治植物病害中起着重要作用。如2,4二乙酰基间苯三酚（2,4diacetylphloroglucinol, DAPG）具有抑制细菌、真菌和卵菌活性[16]，还能作为激发子诱导植物产生系统抗性（Induced systemic resistance，ISR)[17]；硝吡咯菌素对菌核病菌和丝核病菌具有较强的抑制活性[18]；藤黄绿脓菌素（Pyoluteorin, Plt）具有抑制卵菌和细菌的活性[19]；新鉴定的根菌素（Rhizoxin）和脂肽类物质（orfamideA）也具有抑制真菌的活性[2021]；挥发性抑菌物质氢氰酸（Hydrogen cyanide, HCN），有助于防治土传病害[16]。另外，Pf5菌株能产生两种嗜铁素Pyochelin和pyoverdine，这类物质能帮助其竞争铁元素抑制病原物生长[16]。
近期的研究结果表明，pf5菌株含有杀螟虫幼虫活性相关基因簇Fit。该菌株对苗圃的棉蚜（Aphis gossypii Glover）、烟芽夜蛾（Heliothis virescens）和小麦茅虫（Sitodiplosis mosellana）表现出有效口服致死活性。用每毫升仅含1000个假单胞菌细胞的悬浮液喷洒植物叶表面，足以杀死7080％的草地夜蛾（Spodoptera frugiperda?(J.E.Smmith)）和棉铃虫（Helicoverpa armigera Hubner）幼虫[22]。本课题组前期研究结果也表明，Pf5菌株对根结线虫（Meloidogyne incongnita）和秀丽小杆线虫(C.elegans)都具有很强的致死活性。但该菌株以及其Fit基因簇产物对昆虫以及线虫的作用机理还未知。本研究以生防菌Pf5以及其Fit基因簇为研究对象，以模式生物秀丽小杆线虫为作用对象。鉴定该菌株的杀线虫物质以及作用机理。研究为开发新型环保线虫生防药剂奠定理论和实践基础。
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