胡萝卜软腐果胶杆菌vi型分泌系统中两个hcp基因功能的研究
摘要：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,简称Pcc)是一种能引起多种植物患细菌性软腐病的世界性植物病害。目前，尽管与Pcc 致病相关的各种植物细胞降解酶的产生、调节、分泌及相应的表达基因已经得到了一定的研究，但与代谢相关的酶及其与致病性之间的关系尚不明确。，VI型分泌系统（type VI secretion system,T6SS）是新近报道的细菌蛋白分泌系统。为了阐明Pcc其VI型分泌系统中基因簇的功能，本文通过基因敲除的方法构建了Pcc VI型分泌系统中两个hcp（溶血素协同调控蛋白）基因的缺失突变株，并比对了PccS1野生型菌株、突变株在致病性方面的变化。结果表明，Pcc其VI型分泌系统中这两种hcp基因可能与细菌的致病性有关，但并不是其致病性所必要的。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 供试菌株和质粒 2
1.1.1菌株和质粒 2
1.1.2 菌株培养条件及保存 2
1.2 培养基和抗生素 3
1.2.1 培养基 3
1.2.2 抗生素 3
1.3 试验试剂及器材 3
1.3.1 试剂 3
1.3.2 引物 3
1.3.3 器材 3
1.4 试验方法 4
1.4.1 hcp基因缺失突变体的构建 4
1.4.1.1 hcp左右臂的PCR扩增 4
1.4.1.2 片段连接 4
1.4.1.3 热转感受态细胞的制备 4
1.4.1.4 热激转化 5
1.4.1.5重组质粒提取 5
1.4.2 两亲交配筛选突变体 5
1.4.3 白菜致病性试验 6
2 结果与分析 6
2．1 hcp基因转入Top10感受态细胞的验证 6
2．2 hcp基因转入Top10感受态细胞基因质粒提取和酶切验证 7
2．3 转化S171
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
感受态细胞的验证 8
2.4 突变体筛选及验证 8
2．5 白菜致病性的验证 8
3 讨论 10
致谢 10
参考文献： 11
胡萝卜软腐果胶杆菌VI型分泌系统中
两个hcp基因功能的研究
引言
细菌性软腐病是一种常见的危害严重的植物病害，其病原菌主要是胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp．carotovorum，简称Pcc) ,该病菌寄主广泛、防治比较困难。胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种为革兰氏阴性细菌[1]，是多种植物细菌性软腐病的病原菌[2]，而细菌软腐病是一种极为常见也是危害严重的世界性重要细菌性病害之一，在我国曾引起过园艺作物的严重经济损失[34]。其主要通过产生各种植物细胞壁降解酶，破坏寄主植物细胞的防御系统并产生致病症状，这些植物细胞壁降解酶包括果胶酶、纤维素酶、蛋白酶等。随着基因组测序技术的发展以及研究技术升级提高，大量的病原细菌基因组陆续被公布，包括Pcc及其与防治相关的噬菌体的基因组。引起此类病害的主要病原菌有：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种 (Pcc，1998年前为Erwinia carotovora subsp. carotovora)、胡萝卜软腐果胶杆菌黑胫亚种 (Pectobacterterium carotovorum subsp. atroseptica， 1998年前为E. carotovora subsp. atroseptica) 和菊欧文氏菌 (Dickeya dadantii，1998年前为 E. chrysanthemi) [57]。Pcc是革兰氏阴性细菌，菌体呈短杆状，有周生鞭毛28根，无荚膜，不产生芽孢，兼性厌氧型。培养基上菌落为灰白色，圆形或不定形，稍带荧光性，边缘明晰。病菌在436℃之间都能生长发育，2730℃为最适温度，50℃条件下细菌不易存活。病菌在pH5.39.3之间都能生长，以pH7时生长最好。病菌不耐干燥和日光，在室内干燥2min，或在培养基上暴晒10 min即死亡。脱离寄主，可在土壤中单独存活约15天[8,9] 。病菌能分泌小姐寄主细胞中胶层的果胶酶，使细胞分离，组织分离解析。病菌的寄主范围较广，除危害十字花科蔬菜外，还可危害茄科（番茄、辣椒）、豆科（菜豆、豌豆）、瓜类及其他多种作物。
病原细菌通常利用泌出蛋白来介导与寄主植物的相互作用[10]。革兰氏阴性病原细菌可通过微小的装置将蛋白运送到胞外或直接运输到寄主细胞中，这些微小装置被称为分泌系统。迄今为止，发现在革兰氏阴性病原菌中至少存在6种不同类型的分泌系统（I~VI型分泌系统）。其中，VI型分泌系统是近期报道的一种细菌蛋白分泌系统。该系统在细菌中以基因簇形式存在，通常编码12~25个蛋白，核心组分包括IcmF 类蛋白、IcmH类蛋白、AAA+ATP酶、ClpV、未知脂蛋白以及泌出蛋白VgrG和hcp[1113]。
本研究采用同源重组双交换法，构建了Pcc菌株VI型分泌系统核心基因两种hcp基因的缺失突变株，并通过测定突变株致病性的变化，以期评价该基因在Pcc致病过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和质粒
1.1.1菌株和质粒
本研究所涉及的菌株、质粒见表1。
表1 本实验所需菌株及质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
Strains and plasmids
Characteristics
Source
Escherichia coli
Top10
Standard cloning host
Lab collection
S171λpir
λpir pro hsdR, recA
Lab collection
Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum
PccS1
Wild type, RifR
Lab collection
?hcp 3
RifR , KmR , The PccS1_0686 gene knockout mutant of strain PccS1
This study
?hcp 6
RifR , KmR , The PccS1_1748 gene knockout mutant of strain PccS1
This study
Plasmid
pEX18Gm
GmR , Allelic exchange suicide vector, sacB oriT(RP4) LacZ
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 供试菌株和质粒 2
1.1.1菌株和质粒 2
1.1.2 菌株培养条件及保存 2
1.2 培养基和抗生素 3
1.2.1 培养基 3
1.2.2 抗生素 3
1.3 试验试剂及器材 3
1.3.1 试剂 3
1.3.2 引物 3
1.3.3 器材 3
1.4 试验方法 4
1.4.1 hcp基因缺失突变体的构建 4
1.4.1.1 hcp左右臂的PCR扩增 4
1.4.1.2 片段连接 4
1.4.1.3 热转感受态细胞的制备 4
1.4.1.4 热激转化 5
1.4.1.5重组质粒提取 5
1.4.2 两亲交配筛选突变体 5
1.4.3 白菜致病性试验 6
2 结果与分析 6
2．1 hcp基因转入Top10感受态细胞的验证 6
2．2 hcp基因转入Top10感受态细胞基因质粒提取和酶切验证 7
2．3 转化S171
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感受态细胞的验证 8
2.4 突变体筛选及验证 8
2．5 白菜致病性的验证 8
3 讨论 10
致谢 10
参考文献： 11
胡萝卜软腐果胶杆菌VI型分泌系统中
两个hcp基因功能的研究
引言
细菌性软腐病是一种常见的危害严重的植物病害，其病原菌主要是胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp．carotovorum，简称Pcc) ,该病菌寄主广泛、防治比较困难。胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种为革兰氏阴性细菌[1]，是多种植物细菌性软腐病的病原菌[2]，而细菌软腐病是一种极为常见也是危害严重的世界性重要细菌性病害之一，在我国曾引起过园艺作物的严重经济损失[34]。其主要通过产生各种植物细胞壁降解酶，破坏寄主植物细胞的防御系统并产生致病症状，这些植物细胞壁降解酶包括果胶酶、纤维素酶、蛋白酶等。随着基因组测序技术的发展以及研究技术升级提高，大量的病原细菌基因组陆续被公布，包括Pcc及其与防治相关的噬菌体的基因组。引起此类病害的主要病原菌有：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种 (Pcc，1998年前为Erwinia carotovora subsp. carotovora)、胡萝卜软腐果胶杆菌黑胫亚种 (Pectobacterterium carotovorum subsp. atroseptica， 1998年前为E. carotovora subsp. atroseptica) 和菊欧文氏菌 (Dickeya dadantii，1998年前为 E. chrysanthemi) [57]。Pcc是革兰氏阴性细菌，菌体呈短杆状，有周生鞭毛28根，无荚膜，不产生芽孢，兼性厌氧型。培养基上菌落为灰白色，圆形或不定形，稍带荧光性，边缘明晰。病菌在436℃之间都能生长发育，2730℃为最适温度，50℃条件下细菌不易存活。病菌在pH5.39.3之间都能生长，以pH7时生长最好。病菌不耐干燥和日光，在室内干燥2min，或在培养基上暴晒10 min即死亡。脱离寄主，可在土壤中单独存活约15天[8,9] 。病菌能分泌小姐寄主细胞中胶层的果胶酶，使细胞分离，组织分离解析。病菌的寄主范围较广，除危害十字花科蔬菜外，还可危害茄科（番茄、辣椒）、豆科（菜豆、豌豆）、瓜类及其他多种作物。
病原细菌通常利用泌出蛋白来介导与寄主植物的相互作用[10]。革兰氏阴性病原细菌可通过微小的装置将蛋白运送到胞外或直接运输到寄主细胞中，这些微小装置被称为分泌系统。迄今为止，发现在革兰氏阴性病原菌中至少存在6种不同类型的分泌系统（I~VI型分泌系统）。其中，VI型分泌系统是近期报道的一种细菌蛋白分泌系统。该系统在细菌中以基因簇形式存在，通常编码12~25个蛋白，核心组分包括IcmF 类蛋白、IcmH类蛋白、AAA+ATP酶、ClpV、未知脂蛋白以及泌出蛋白VgrG和hcp[1113]。
本研究采用同源重组双交换法，构建了Pcc菌株VI型分泌系统核心基因两种hcp基因的缺失突变株，并通过测定突变株致病性的变化，以期评价该基因在Pcc致病过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和质粒
1.1.1菌株和质粒
本研究所涉及的菌株、质粒见表1。
表1 本实验所需菌株及质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
Strains and plasmids
Characteristics
Source
Escherichia coli
Top10
Standard cloning host
Lab collection
S171λpir
λpir pro hsdR, recA
Lab collection
Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum
PccS1
Wild type, RifR
Lab collection
?hcp 3
RifR , KmR , The PccS1_0686 gene knockout mutant of strain PccS1
This study
?hcp 6
RifR , KmR , The PccS1_1748 gene knockout mutant of strain PccS1
This study
Plasmid
pEX18Gm
GmR , Allelic exchange suicide vector, sacB oriT(RP4) LacZ
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