肠杆菌软腐菌pccpba中ed途径edd基因功能研究
摘要：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp．carotovorum，Pcc) ，为革兰氏阴性细菌，是多种植物细菌性软腐病的病原菌，PccS1引起的软腐病一直都是植物病理学研究的重要内容之一，特别是在其全基因序列公布( 2002 )后，与其致病相关的研究更有所增加。黑胫果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum,Pba)是一种只能在马铃薯上引起软腐病的革兰氏阴性植物病原菌。二者均属于肠杆菌科软腐菌（soft rot Enterbacteriaceae）。恩特纳－道特洛夫代谢途径（Entner-Doudoroff pathway，简称ED pathway）广泛分布于革兰氏阴性菌中，可与EMP 和TCA 等途径相连接，向菌体提供能量、还原力及各种中间代谢产物。ED途径有两个关键酶，一个是6-磷酸葡萄糖酸脱水酶（Edd，EC 4.2.1.12），另一个是KDPG 醛缩酶（Eda，EC 4.2.1.14）。Edd催化6-磷酸葡萄糖酸形成2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸（2-keto-3-deoxygluconate-6-phosphate, KDPG），而Eda 将KDPG 分解形成丙酮酸和3-磷酸甘油醛。其中eda在PccS1中与致病相关。基因组比较发现Pba中有完整的ED途径，而Pcc中缺乏关键酶之一的Edd。本研究主要通过将Pba的edd基因回补到PccS1中来研究ED途径在致病过程中的主要作用。互补菌株展示了Edd表达和ED途径的功能，但是没有改变致病性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言1
1材料与方法2
1.1供试菌株和质粒2
1.1.1菌株和质粒2
1.1.2 菌株培养条件及保存3
1.2 培养基和抗生素2
1.2.1培养基3
1.2.2抗生素3
1.3 试验试剂及器材3
1.3.1 试剂3
1.3.2 引物3
1.3.3 器材4
1.4 试验方法4
1.4.1重组载体的构建4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
> 1.4.1.1 eddpba基因上下游片段的克隆4
1.4.1.2 片段连接4
1.4.1.3 热转感受态细胞的制备4
1.4.1.4 热激转化5
1.4.1.5重组载体验证5
1.4.1.6重组质粒提取5
1.4.2 重组菌株构建及验证6
1.4.2.1供体菌验证6
1.4.2.2两亲6
1.4.2.3洗膜6
1.4.2.4重组菌株筛选7
1.4.2.5 western验证7
1.4.2.6 EddEda组合酶活测定7
1.4.3 细菌致病性的测定7
2 结果与分析8
2.1载体酶切及互补菌株验证8
2.2互补菌株western验证8
2.3 EddEda组合酶活测定8
2.4互补菌株不影响致病性9
3讨论10
致谢10
参考文献11
肠杆菌软腐菌Pcc、Pba中ED途径edd基因功能研究
引言
胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp．carotovorum，简称Pcc) ，为革兰氏阴性细菌[1]，是多种植物细菌性软腐病的病原菌[2]，能够在彩色马蹄莲、胡萝卜、黄瓜、辣椒、大白菜和马铃薯等寄主上引起严重的细菌性软腐病，也能引起多种水果蔬菜贮藏期腐烂[3]。细胞壁降解酶，如果胶裂解酶、纤维素酶和蛋白酶等，被认为是Pcc的主要致病因子。细菌性软腐病病状随寄主和外界条件的差异而略有变化，一般来说，柔嫩多汁的组织更易受到侵染，呈水浸半透明状，在病斑边缘有明显的界限，后随病势发展病组织软化，病斑变为褐色，且病健交界限逐渐模糊，出现腐烂并伴随恶臭味，待水分蒸发后，组织干缩[4]。Pcc引起的软腐病一直都是植物病理学研究的重要内容之一，特别是在其全基因序列公布( 2002 )后，与其致病相关的研究更有所增加[5]。其引起的软腐病已经给全世界农业带来严重的经济损失，因此对其致病机制的研究已显得越来越重要。
黑胫果胶杆菌和胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种均属于肠杆菌科软腐菌（soft rot Enterobacteriaceae）。黑胫果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum,Pba)是一种只能引起马铃薯黑胫病的革兰氏阴性植物病原菌。马铃薯黑胫病菌主要侵染茎或薯块，从苗期到生育后期均可发病。种薯染病腐烂成粘团状，不发芽，或刚发芽即烂在土中，不能出苗。幼苗染病一般株高15～18cm出现症状，植株矮小，节间短缩，或叶片上卷，褪绿黄化，或胫部变黑，萎蔫而死。茎横切可见三条主要维管束变为褐色。薯块染病始于脐部，呈放射状向髓部扩展，病部黑褐色，横切可见维管束亦呈黑褐色，用手压挤皮肉不分离，湿度大时，薯块变为黑褐色，腐烂发臭，对马铃薯产量造成巨大危害。
恩特纳－道特洛夫代谢途径（EntnerDoudoroff pathway，简称：ED pathway）广泛分布于革兰氏阴性菌中，可与EMP 和TCA 等途径相连接，向菌体提供能量、还原力及各种中间代谢产物[6]。恩特纳（Entner）和道特洛夫（Doudoroff）于1952 在研究嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharorhila)时首次发现了ED途径，人们随后在大肠杆菌中发现也存在同一途径，最后发现在整个微生物系统中甚至包括古生菌中都存在着ED 途径[7]。因此在代谢途径演化过程中，有研究认为，ED 途径先于EMP 途径形成[8]。在胡萝卜软腐果胶杆菌致病相关基因的筛选及功能分析中，ED 途径是其葡萄糖代谢的主要途径[9], 而在大肠杆菌中，ED 途径对其在大肠中的定殖发挥着重要作用。
ED途径有两个关键酶，一个是6磷酸葡萄糖酸脱水酶（Edd，EC 4.2.1.12），另一个是KDPG 醛缩酶（Eda，EC 4.2.1.14）。Edd催化6磷酸葡萄糖酸形成2酮3脱氧6磷酸葡萄糖酸（2keto3deoxygluconate6phosphate, KDPG），而Eda 将KDPG 分解形成丙酮酸和3磷酸甘油醛[10]。其中Eda在Pcc中与致病相关。基因组比较发现Pba中有完整的ED途径，而Pcc中缺乏关键酶之一的Edd。本研究主要通过将Pba的edd基因互补到PccS1中来研究ED途径在致病过程中的主要作用。
本实验通过目标基因的提取、基因载体构建、在寄主中的表达及其致病性相关研究，为软腐果胶杆菌的致病机理和软腐病的防治方法的研究提供一定的参考，为世界范围内细菌软腐病的防治做出贡献。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和质粒
1.1.1菌株和质粒
本研究所涉及的菌株、质粒见表1。
表1本研究所用菌株与质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株或质粒Strains/Plasmids
相关特性
Characteristics
来源
Source
Escherichia coli
DH5α
Φ80 lacZΔM15，(lacZYAargF)U169． recA1，endA1． thi1
Lab collection
S171λpir
λpir pro hsdR，recA
Lab collection
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言1
1材料与方法2
1.1供试菌株和质粒2
1.1.1菌株和质粒2
1.1.2 菌株培养条件及保存3
1.2 培养基和抗生素2
1.2.1培养基3
1.2.2抗生素3
1.3 试验试剂及器材3
1.3.1 试剂3
1.3.2 引物3
1.3.3 器材4
1.4 试验方法4
1.4.1重组载体的构建4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
> 1.4.1.1 eddpba基因上下游片段的克隆4
1.4.1.2 片段连接4
1.4.1.3 热转感受态细胞的制备4
1.4.1.4 热激转化5
1.4.1.5重组载体验证5
1.4.1.6重组质粒提取5
1.4.2 重组菌株构建及验证6
1.4.2.1供体菌验证6
1.4.2.2两亲6
1.4.2.3洗膜6
1.4.2.4重组菌株筛选7
1.4.2.5 western验证7
1.4.2.6 EddEda组合酶活测定7
1.4.3 细菌致病性的测定7
2 结果与分析8
2.1载体酶切及互补菌株验证8
2.2互补菌株western验证8
2.3 EddEda组合酶活测定8
2.4互补菌株不影响致病性9
3讨论10
致谢10
参考文献11
肠杆菌软腐菌Pcc、Pba中ED途径edd基因功能研究
引言
胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp．carotovorum，简称Pcc) ，为革兰氏阴性细菌[1]，是多种植物细菌性软腐病的病原菌[2]，能够在彩色马蹄莲、胡萝卜、黄瓜、辣椒、大白菜和马铃薯等寄主上引起严重的细菌性软腐病，也能引起多种水果蔬菜贮藏期腐烂[3]。细胞壁降解酶，如果胶裂解酶、纤维素酶和蛋白酶等，被认为是Pcc的主要致病因子。细菌性软腐病病状随寄主和外界条件的差异而略有变化，一般来说，柔嫩多汁的组织更易受到侵染，呈水浸半透明状，在病斑边缘有明显的界限，后随病势发展病组织软化，病斑变为褐色，且病健交界限逐渐模糊，出现腐烂并伴随恶臭味，待水分蒸发后，组织干缩[4]。Pcc引起的软腐病一直都是植物病理学研究的重要内容之一，特别是在其全基因序列公布( 2002 )后，与其致病相关的研究更有所增加[5]。其引起的软腐病已经给全世界农业带来严重的经济损失，因此对其致病机制的研究已显得越来越重要。
黑胫果胶杆菌和胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种均属于肠杆菌科软腐菌（soft rot Enterobacteriaceae）。黑胫果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum,Pba)是一种只能引起马铃薯黑胫病的革兰氏阴性植物病原菌。马铃薯黑胫病菌主要侵染茎或薯块，从苗期到生育后期均可发病。种薯染病腐烂成粘团状，不发芽，或刚发芽即烂在土中，不能出苗。幼苗染病一般株高15～18cm出现症状，植株矮小，节间短缩，或叶片上卷，褪绿黄化，或胫部变黑，萎蔫而死。茎横切可见三条主要维管束变为褐色。薯块染病始于脐部，呈放射状向髓部扩展，病部黑褐色，横切可见维管束亦呈黑褐色，用手压挤皮肉不分离，湿度大时，薯块变为黑褐色，腐烂发臭，对马铃薯产量造成巨大危害。
恩特纳－道特洛夫代谢途径（EntnerDoudoroff pathway，简称：ED pathway）广泛分布于革兰氏阴性菌中，可与EMP 和TCA 等途径相连接，向菌体提供能量、还原力及各种中间代谢产物[6]。恩特纳（Entner）和道特洛夫（Doudoroff）于1952 在研究嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharorhila)时首次发现了ED途径，人们随后在大肠杆菌中发现也存在同一途径，最后发现在整个微生物系统中甚至包括古生菌中都存在着ED 途径[7]。因此在代谢途径演化过程中，有研究认为，ED 途径先于EMP 途径形成[8]。在胡萝卜软腐果胶杆菌致病相关基因的筛选及功能分析中，ED 途径是其葡萄糖代谢的主要途径[9], 而在大肠杆菌中，ED 途径对其在大肠中的定殖发挥着重要作用。
ED途径有两个关键酶，一个是6磷酸葡萄糖酸脱水酶（Edd，EC 4.2.1.12），另一个是KDPG 醛缩酶（Eda，EC 4.2.1.14）。Edd催化6磷酸葡萄糖酸形成2酮3脱氧6磷酸葡萄糖酸（2keto3deoxygluconate6phosphate, KDPG），而Eda 将KDPG 分解形成丙酮酸和3磷酸甘油醛[10]。其中Eda在Pcc中与致病相关。基因组比较发现Pba中有完整的ED途径，而Pcc中缺乏关键酶之一的Edd。本研究主要通过将Pba的edd基因互补到PccS1中来研究ED途径在致病过程中的主要作用。
本实验通过目标基因的提取、基因载体构建、在寄主中的表达及其致病性相关研究，为软腐果胶杆菌的致病机理和软腐病的防治方法的研究提供一定的参考，为世界范围内细菌软腐病的防治做出贡献。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和质粒
1.1.1菌株和质粒
本研究所涉及的菌株、质粒见表1。
表1本研究所用菌株与质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株或质粒Strains/Plasmids
相关特性
Characteristics
来源
Source
Escherichia coli
DH5α
Φ80 lacZΔM15，(lacZYAargF)U169． recA1，endA1． thi1
Lab collection
S171λpir
λpir pro hsdR，recA
Lab collection
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
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