双酚e对斑马鱼的毒性效应研究
双酚A类物质是近年来较受关注的有机污染物。双酚E是双酚A(BPA)的同系物之一，广泛用于医疗器械、食品包装材料、塑料制品等领域，其具有的雌激素作用和内分泌干扰活性相当于双酚 A，但是现在BPE对斑马鱼的毒性效应的研究还鲜有报道。本文采用浓度为0.001,、0.01、0.1、1mg/L的BPE对年轻斑马鱼进行水体暴露21d。研究结果表明，1mg/L BPE降低了斑马鱼的繁殖力，使产卵量、孵化率和存活率均显著性降低。组织病理学检验表明BPE对斑马鱼的精巢和卵巢具有一定的损伤作用。0.1、1mg/L BPE暴露导致雄鱼匀浆液中的雄激素浓度显著降低，0.01、0.1、1mg/L BPE暴露导致雄鱼匀浆液中的雌激素浓度显著升高，1mg/L BPE暴露使斑马鱼下丘脑-垂体-性腺轴相关基因表达量显著上升，说明BPE具有一定的雌激素效应。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
材料与方法 3
实验仪器与试剂 3
仪器3
试剂3
1.2 实验动物的饲养 3
1.3 化合物的暴露 3
1.3.1 急性毒性暴露实验 3
1.3.2 亚急性毒性暴露实验 4
1.4 产卵量、孵化率及七日幼鱼存活率和生长发育指标统计 4
1.5 组织病理学观察 4
1.6 激素水平的测定 4
1.7 RNA提取及基因测定 5
1.7.1 RNA提取 5
1.7.2 实时荧光定量PCR检测斑马鱼发育相关基因的表达 5
1.8 数据分析 5
2 结果与分析 6
2.1 死亡率和生长情况 6
2.2 产卵量、孵化率和七日幼鱼存活率统计 6
2.3 组织病理学观察 8
2.4 激素水平测定 9
2.5 相关基因的荧光定量RTPCR检测结果 11
3 讨论 11
致谢 12
参考文献 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
12
双酚E对斑马鱼的毒性效应研究
引言
引言
近几年来，双酚类物质的普遍使用导致环境中这类物质的含量不断增加，目前被证实具有内分泌干扰效应的双酚类物质也有很多。随着BPA的限制使用，一种新型的双酚类化合物BPE出现在人们的生产生活中。BPE是一种双酚A类似物，其生物毒性和内分泌干扰活性相当于双酚A，是一种典型的环境内分泌干扰物。双酚类物质是全球生产量最大的化学原料之一，是生产高分子材料如聚碳酸酯、环氧树脂、增塑剂等的前体物质，广泛应用于杀菌剂、染料、医疗器械、食品包装材料及某些家庭用具等的生产。当含有BPA类物质的生活用品暴露于高温、碱性等环境中时，BPA类物质就会释放出来，通过各种途径暴露进入人体。目前研究发现BPA类物质不仅广泛存在于食物、水、车外环境中，在人类尿液、血液以及母乳中也有检出报道[1]。研究表明，BPA类物质具有内分泌干扰作用，对雄性生殖系统有一定的损害[2]，可能会引起性早熟[3]，对胚胎也会有一定的影响[4]。在低浓度长时间暴露的情况下，BPA类物质就可以对原代和子代生殖系统及其发育、对脑和神经系统及免疫系统等有不良的影响，可能会引发癌症、肥胖、糖尿病、生殖障碍和神经系统紊乱等多种疾病。考虑到BPA类物质的潜在低剂量效应以及动物试验的不确定性，部分国家已经开始限制含BPA类塑料制品的使用，尤其是对婴幼儿等敏感人群[5]，许多国家也采取了禁用政策。为了应对这些管制措施，一些双酚A替代物被开发用于塑料、食品包装材料等的生产中[6,8]。因此研究双酚A类物质的毒理学效应及其作用机制具有重要意义。
BPA类物质与人类生活息息相关，在长期的使用过程中，受到外界环境如温度、压力、pH值等的影响，它们会从本体物质中析出，暴露于环境中。2012年 Liao[9]等对美国、日本和韩国3地工业地区沉积物检测发现，美国、日本和韩国样本中均可检测出BPA类物质。Yuan[10]等在一条长期受工业和生活废弃物污染的河流浅层和深层沉积物中也检测到了BPA类物质。BPA类物质通过与雌激素受体结合发挥出内分泌干扰效应。因此很有必要以水生生物作为受体，研究水体和沉积物中的BPE类物质对水生生物的毒性作用。
鱼类是水体中重要的水生生物类群，当水体受到化合物的污染时，鱼类必然首当其冲。鱼类具有与哺乳动物相似的生理系统，特别是生殖内分泌系统与其他脊椎动物具有很大的相似性，许多污染物引起的功能紊乱可能与人相似，因此在鱼类中发现的污染效应可以应用到其他它脊椎动物，甚至是人类。
鱼类在繁殖季节可以将大量的卵子释放到环境中，通过观察其产卵数、受精率和后代的存活率来评价污染物对鱼类的生长发育和繁殖的影响。另外，鱼类还适合在野外环境和实验室中生长，可以在控制条件下进行不同暴露途径的测试或在不同生命阶段进行测试。相比较哺乳动物，利用鱼类进行污染物的长期效应研究要容易的多。因此鱼类实验在生态风险评价中具有重要的实验价值，经济合作与发展组织(OECD)和美国环保局(EPA)都选择用鱼作为各种体内实验的模式生物。
在下丘脑垂体性腺轴（HPG）中，所有脊椎动物下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH）, GnRH调解垂体分泌促性腺激素（GTH），GTH调解性腺合成性激素，同时性激素也可以反馈给下丘脑和垂体。鱼的性腺不仅仅是生殖器官，亦是性激素分泌器官。硬骨鱼类的卵巢和精巢通常是一对纵列的器官。卵巢是雌二醇合成的唯一来源，它亦是睾酮的主要合成器官，但是睾酮还可能由性腺以外的组织合成[11]。
在类固醇激素的代谢过程中，需要多种酶参与催化，其中一种酶称为芳香化酶（aromatase），起着关键的作用。芳香化酶属于细胞色素P450家族，它催化雄激素（如睾酮）转化为雌激素，是雌激素生物合成中的限速酶。研究表明，经由芳香化酶催化雄激素转化而来的雌激素不仅作用于生殖系统和生殖行为，也影响脑的发育及功能。在斑马鱼等多种硬骨鱼类中发现由两种不同基因编码的P450arom（CYP19A和CYP19B），在脑组织中以CYP19B表达为主，在性腺中以CYP19A表达为主。在鱼类性别分化和性逆转实验中，芳香化酶是相对研究较多的一种酶类，它的活性和表达的强弱，在一定程度上可以反映雌激素的生物合成情况[11]。
鱼类卵黄原蛋白（vitellogenin,VTG）是卵黄蛋白的前体，它对鱼类的生殖非常重要。肝脏VTG合成过程是下丘脑垂体性腺神经内分泌周通过环境或內源信号激活下发生的自然过程[12]。卵黄原蛋白在卵黄形成期雌激素刺激下由肝脏合成的一种大分子量的磷酸脂糖蛋白，通过血液运输到发育的卵巢中，被卵巢吸收，作为胚胎发育的营养源，研究表明鱼类、两栖类和鸟类的卵黄蛋白是由肝脏合成的卵黄蛋白原的衍生物，卵黄蛋白原通过循环系统运送至卵细胞，进而形成卵黄蛋白。在无脊椎动物中，卵黄由卵细胞合成，或者由滤泡细胞或卵巢以外的组织合成。在鱼类，它是雌鱼的特异性蛋白，但是由于雄鱼的肝脏中也有VTG基因，因而雌激素也能诱导雄鱼肝脏合成和分泌VTG。除雌激素外，具有雌激素活性的环境内分泌干扰物（EDCs）也可以诱导雄鱼VTG的产生，因而VTG已成为内分泌扰乱化学物质筛选的理想生物标记物。VTG作为生物标记物的基础是目前能够成功地定性和定量VTG。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
材料与方法 3
实验仪器与试剂 3
仪器3
试剂3
1.2 实验动物的饲养 3
1.3 化合物的暴露 3
1.3.1 急性毒性暴露实验 3
1.3.2 亚急性毒性暴露实验 4
1.4 产卵量、孵化率及七日幼鱼存活率和生长发育指标统计 4
1.5 组织病理学观察 4
1.6 激素水平的测定 4
1.7 RNA提取及基因测定 5
1.7.1 RNA提取 5
1.7.2 实时荧光定量PCR检测斑马鱼发育相关基因的表达 5
1.8 数据分析 5
2 结果与分析 6
2.1 死亡率和生长情况 6
2.2 产卵量、孵化率和七日幼鱼存活率统计 6
2.3 组织病理学观察 8
2.4 激素水平测定 9
2.5 相关基因的荧光定量RTPCR检测结果 11
3 讨论 11
致谢 12
参考文献 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
12
双酚E对斑马鱼的毒性效应研究
引言
引言
近几年来，双酚类物质的普遍使用导致环境中这类物质的含量不断增加，目前被证实具有内分泌干扰效应的双酚类物质也有很多。随着BPA的限制使用，一种新型的双酚类化合物BPE出现在人们的生产生活中。BPE是一种双酚A类似物，其生物毒性和内分泌干扰活性相当于双酚A，是一种典型的环境内分泌干扰物。双酚类物质是全球生产量最大的化学原料之一，是生产高分子材料如聚碳酸酯、环氧树脂、增塑剂等的前体物质，广泛应用于杀菌剂、染料、医疗器械、食品包装材料及某些家庭用具等的生产。当含有BPA类物质的生活用品暴露于高温、碱性等环境中时，BPA类物质就会释放出来，通过各种途径暴露进入人体。目前研究发现BPA类物质不仅广泛存在于食物、水、车外环境中，在人类尿液、血液以及母乳中也有检出报道[1]。研究表明，BPA类物质具有内分泌干扰作用，对雄性生殖系统有一定的损害[2]，可能会引起性早熟[3]，对胚胎也会有一定的影响[4]。在低浓度长时间暴露的情况下，BPA类物质就可以对原代和子代生殖系统及其发育、对脑和神经系统及免疫系统等有不良的影响，可能会引发癌症、肥胖、糖尿病、生殖障碍和神经系统紊乱等多种疾病。考虑到BPA类物质的潜在低剂量效应以及动物试验的不确定性，部分国家已经开始限制含BPA类塑料制品的使用，尤其是对婴幼儿等敏感人群[5]，许多国家也采取了禁用政策。为了应对这些管制措施，一些双酚A替代物被开发用于塑料、食品包装材料等的生产中[6,8]。因此研究双酚A类物质的毒理学效应及其作用机制具有重要意义。
BPA类物质与人类生活息息相关，在长期的使用过程中，受到外界环境如温度、压力、pH值等的影响，它们会从本体物质中析出，暴露于环境中。2012年 Liao[9]等对美国、日本和韩国3地工业地区沉积物检测发现，美国、日本和韩国样本中均可检测出BPA类物质。Yuan[10]等在一条长期受工业和生活废弃物污染的河流浅层和深层沉积物中也检测到了BPA类物质。BPA类物质通过与雌激素受体结合发挥出内分泌干扰效应。因此很有必要以水生生物作为受体，研究水体和沉积物中的BPE类物质对水生生物的毒性作用。
鱼类是水体中重要的水生生物类群，当水体受到化合物的污染时，鱼类必然首当其冲。鱼类具有与哺乳动物相似的生理系统，特别是生殖内分泌系统与其他脊椎动物具有很大的相似性，许多污染物引起的功能紊乱可能与人相似，因此在鱼类中发现的污染效应可以应用到其他它脊椎动物，甚至是人类。
鱼类在繁殖季节可以将大量的卵子释放到环境中，通过观察其产卵数、受精率和后代的存活率来评价污染物对鱼类的生长发育和繁殖的影响。另外，鱼类还适合在野外环境和实验室中生长，可以在控制条件下进行不同暴露途径的测试或在不同生命阶段进行测试。相比较哺乳动物，利用鱼类进行污染物的长期效应研究要容易的多。因此鱼类实验在生态风险评价中具有重要的实验价值，经济合作与发展组织(OECD)和美国环保局(EPA)都选择用鱼作为各种体内实验的模式生物。
在下丘脑垂体性腺轴（HPG）中，所有脊椎动物下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH）, GnRH调解垂体分泌促性腺激素（GTH），GTH调解性腺合成性激素，同时性激素也可以反馈给下丘脑和垂体。鱼的性腺不仅仅是生殖器官，亦是性激素分泌器官。硬骨鱼类的卵巢和精巢通常是一对纵列的器官。卵巢是雌二醇合成的唯一来源，它亦是睾酮的主要合成器官，但是睾酮还可能由性腺以外的组织合成[11]。
在类固醇激素的代谢过程中，需要多种酶参与催化，其中一种酶称为芳香化酶（aromatase），起着关键的作用。芳香化酶属于细胞色素P450家族，它催化雄激素（如睾酮）转化为雌激素，是雌激素生物合成中的限速酶。研究表明，经由芳香化酶催化雄激素转化而来的雌激素不仅作用于生殖系统和生殖行为，也影响脑的发育及功能。在斑马鱼等多种硬骨鱼类中发现由两种不同基因编码的P450arom（CYP19A和CYP19B），在脑组织中以CYP19B表达为主，在性腺中以CYP19A表达为主。在鱼类性别分化和性逆转实验中，芳香化酶是相对研究较多的一种酶类，它的活性和表达的强弱，在一定程度上可以反映雌激素的生物合成情况[11]。
鱼类卵黄原蛋白（vitellogenin,VTG）是卵黄蛋白的前体，它对鱼类的生殖非常重要。肝脏VTG合成过程是下丘脑垂体性腺神经内分泌周通过环境或內源信号激活下发生的自然过程[12]。卵黄原蛋白在卵黄形成期雌激素刺激下由肝脏合成的一种大分子量的磷酸脂糖蛋白，通过血液运输到发育的卵巢中，被卵巢吸收，作为胚胎发育的营养源，研究表明鱼类、两栖类和鸟类的卵黄蛋白是由肝脏合成的卵黄蛋白原的衍生物，卵黄蛋白原通过循环系统运送至卵细胞，进而形成卵黄蛋白。在无脊椎动物中，卵黄由卵细胞合成，或者由滤泡细胞或卵巢以外的组织合成。在鱼类，它是雌鱼的特异性蛋白，但是由于雄鱼的肝脏中也有VTG基因，因而雌激素也能诱导雄鱼肝脏合成和分泌VTG。除雌激素外，具有雌激素活性的环境内分泌干扰物（EDCs）也可以诱导雄鱼VTG的产生，因而VTG已成为内分泌扰乱化学物质筛选的理想生物标记物。VTG作为生物标记物的基础是目前能够成功地定性和定量VTG。
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