稻瘟病菌morgs基因的原核表达研究
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)能侵染水稻、大麦、小麦及黍类作物，由该病菌引起的稻瘟病是世界水稻生产上最严重的真菌病害之一，该病菌已成为一种研究植物—病原菌互作的非常重要的模式病原菌。在本研究室前期报道中，共鉴定和克隆到8个稻瘟病菌的MoRGS基因(MoRGS1-8)，对这些基因进行生物学功能分析发现，MoRGS基因参与稻瘟病菌的生长，产孢，附着胞形成，有性生殖及致病性等生物学过程，但目前对这些MoRGS基因的调控机制研究还不够完善。因此，为了深入的解析MoRgs蛋白的调控机制，本研究利用MoRGS1-8的引物进行PCR扩增获得了MoRGS1-8的基因片段，将扩增获得的PCR产物纯化后经限制性内切酶酶切，克隆至表达载体pET32a，成功构建了pET32a::MoRGS1-8原核表达载体。进一步将上述载体转化到工程菌BL21，对阳性克隆进行蛋白诱导，成功获得了4个目的基因的表达蛋白。SDS-PAGE分析显示MoRGS1、MoRGS4、MoRGS7和MoRGS8都获得了目的蛋白大小的条带。上述研究结果对解析MoRgs蛋白的晶体结构并为深入探讨MoRgs在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的分子调控机制奠定了坚实的基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言4
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1仪器与试剂 5
1.1.2 供试质粒及菌株 5
1.1.3菌株培养条件 5
1.2方法 5
1.2.1原核表达载体的片段扩增5
1.2.2 TA克隆5
1.2.3 酶切并连接到pET32a6
1.2.4大肠杆菌的转化及质粒提取 6
1.2.5 BL21的转化6
1.2.6诱导蛋白表达 6
1.2.7蛋白的收集及纯化 7
1.2.8目的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 7
2结果与分析7
2.1载体构建7
2.1.1 原核表达载体的片段扩增 7
2.1.2 TA克隆7
2.1.3 酶切验证 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
8
2.2 原核表达诱导 9
3讨论9
致谢 10
参考文献 11
稻瘟病菌MoRGS基因的原核表达研究
引言
引言 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是世界水稻生产上的毁灭性真菌病害，该病菌已成为研究植物—病原菌互作的模式生物[1]。稻瘟病菌的致病过程是稻瘟病菌和水稻寄主相互识别、相互作用的过程。稻瘟病菌以一种真菌典型的方式侵染水稻:分生孢子接触到水稻叶片后，萌发成芽管，随后在芽管尖端分化成一个独特的侵染结构－附着胞。附着胞内产生巨大的膨压，在压力作用下侵入钉可以穿透叶片表皮产生侵入叶片并产生侵入菌丝，进一步侵染水稻细胞。之后病斑处会产生大量的分生孢子，从而引起新的侵染过程[2]。
G蛋白信号调控因子(Regulators of Gprotein signaling, RGS)通过调控异三聚体G蛋白，使真核生物对外界信号刺激作出应答而参与调控生物体的生理活动。异三聚体G蛋白与膜受体偶联，它是受鸟苷酸调控的超级家族的信号传导分子，由α、β和γ三个亚基组成。其中α是异三聚体鸟苷酸的结合位点[3]。在没有外界信号刺激的情况下，G蛋白Gα亚基与GDP结合，Gα与Gβ及Gγ亚基以一个异三聚体的复合物存在。当感受外界信号后，GPCR作为鸟苷酸交换因子(guaninenucleotide exchange factor: GEF)和信号分子结合引起构象改变，形成激活型受体，并与G蛋白的Gα亚基结合，导致Gα亚基构象改变，释放GDP，结合GTP，形成激活态的Gα亚基，失去了Gα亚基的异三聚体仍可结合作为Gβ及Gγ的异二聚体，作用于下游的效应分子，异二聚体与下游的效应分子结合将信号传递[4, 5]。G蛋白下游的效应分子有多种，包括腺苷酸环化酶、磷脂酶、蛋白激酶Ste20等。将信号传递给下游效应分子后，Gα亚基自身的GTP酶水解活性将GTP水解为GDP，使Gα与GDP结合，与Gβγ亚基复合体重新聚合为失活的异三聚体状态，最终关闭GPCR信号[6, 7]，完成一次信号跨膜转换。
迄今为止，在G蛋白的研究中，对其模式真菌酿酒酵母的RGS功能研究的最清楚[3]。在稻瘟病菌中，G蛋白参与调控营养生长、致病性、产孢及侵染结构的分化等生理过程，同时G蛋白信号调控因子RGS1作为Gα亚基的负调控因子参与无性繁殖及附着胞的分化等过程[8]，在稻瘟病菌生长发育及致病过程中具有重要的作用。本研究室在前期研究中鉴定和克隆到8个稻瘟病菌的RGS基因(MoRGS18) [9]。对这些基因进行生物学功能分析发现，RGS基因在稻瘟病菌无性繁殖、有性生殖、致病性，胞外漆酶和过氧化物酶活性、细胞壁完整性过程中具有重要的调控作用[9]。但是，这些蛋白调控这一系列生物学表型的分子机制尚不清楚。本文将采用原核表达方法诱导获得这些基因的纯蛋白，试图解析这些蛋白的晶体结构，从而揭示其在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的分子调控机制。研究结果对阐明稻瘟病菌的致病分子机理具有重要的理论意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1. 1. 1 仪器与试剂
真核TA 克隆试剂盒；XhoI、EcoRI、SacI和HindIII等限制性内切酶；PCR仪。
1．1．2 供试质粒及菌株
供试质粒是pET32a，供试菌株为稻瘟病菌野生型菌株Guy11，以及大肠杆菌DH5α和BL21。
1．1．3 菌株培养条件
供试菌株稻瘟病菌野生型菌株Guy11采用滤纸片法保存于20℃；野生型菌株Guy11在28℃条件下培养于完全培养基(CM)[13]。大肠杆菌菌株DH5α，BL21均接种于LB培养基中，37℃条件下培养。
1．2 方法
1．2．1 原核表达载体的片段扩增
利用引物分别进行PCR扩增得到MoRGS18基因片段并纯化回收。
引物编号
引物序列
MoRGS1
32aFEcoRI:GAATTCCGCATGGACAAGATCCTGAAC
32aRHindIII:AAGCTTGGAGTAGATGCTCGTACCTGCG
MoRGS2
32aFEcoRI:GAATTCACGCTACAGGAAATACTTGCC
32aRHindIII:AAGCTTGGTCATACTCTGAAAGGTGCATC
MoRGS3
32aFEcoRI:GAATTCTCGCCTCAACCCGACATAAC
32aRXhoI:CTCGAGTGATAAGGTTTCCCAAAGCCTTCAT
MoRGS4
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言4
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1仪器与试剂 5
1.1.2 供试质粒及菌株 5
1.1.3菌株培养条件 5
1.2方法 5
1.2.1原核表达载体的片段扩增5
1.2.2 TA克隆5
1.2.3 酶切并连接到pET32a6
1.2.4大肠杆菌的转化及质粒提取 6
1.2.5 BL21的转化6
1.2.6诱导蛋白表达 6
1.2.7蛋白的收集及纯化 7
1.2.8目的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 7
2结果与分析7
2.1载体构建7
2.1.1 原核表达载体的片段扩增 7
2.1.2 TA克隆7
2.1.3 酶切验证 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
8
2.2 原核表达诱导 9
3讨论9
致谢 10
参考文献 11
稻瘟病菌MoRGS基因的原核表达研究
引言
引言 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是世界水稻生产上的毁灭性真菌病害，该病菌已成为研究植物—病原菌互作的模式生物[1]。稻瘟病菌的致病过程是稻瘟病菌和水稻寄主相互识别、相互作用的过程。稻瘟病菌以一种真菌典型的方式侵染水稻:分生孢子接触到水稻叶片后，萌发成芽管，随后在芽管尖端分化成一个独特的侵染结构－附着胞。附着胞内产生巨大的膨压，在压力作用下侵入钉可以穿透叶片表皮产生侵入叶片并产生侵入菌丝，进一步侵染水稻细胞。之后病斑处会产生大量的分生孢子，从而引起新的侵染过程[2]。
G蛋白信号调控因子(Regulators of Gprotein signaling, RGS)通过调控异三聚体G蛋白，使真核生物对外界信号刺激作出应答而参与调控生物体的生理活动。异三聚体G蛋白与膜受体偶联，它是受鸟苷酸调控的超级家族的信号传导分子，由α、β和γ三个亚基组成。其中α是异三聚体鸟苷酸的结合位点[3]。在没有外界信号刺激的情况下，G蛋白Gα亚基与GDP结合，Gα与Gβ及Gγ亚基以一个异三聚体的复合物存在。当感受外界信号后，GPCR作为鸟苷酸交换因子(guaninenucleotide exchange factor: GEF)和信号分子结合引起构象改变，形成激活型受体，并与G蛋白的Gα亚基结合，导致Gα亚基构象改变，释放GDP，结合GTP，形成激活态的Gα亚基，失去了Gα亚基的异三聚体仍可结合作为Gβ及Gγ的异二聚体，作用于下游的效应分子，异二聚体与下游的效应分子结合将信号传递[4, 5]。G蛋白下游的效应分子有多种，包括腺苷酸环化酶、磷脂酶、蛋白激酶Ste20等。将信号传递给下游效应分子后，Gα亚基自身的GTP酶水解活性将GTP水解为GDP，使Gα与GDP结合，与Gβγ亚基复合体重新聚合为失活的异三聚体状态，最终关闭GPCR信号[6, 7]，完成一次信号跨膜转换。
迄今为止，在G蛋白的研究中，对其模式真菌酿酒酵母的RGS功能研究的最清楚[3]。在稻瘟病菌中，G蛋白参与调控营养生长、致病性、产孢及侵染结构的分化等生理过程，同时G蛋白信号调控因子RGS1作为Gα亚基的负调控因子参与无性繁殖及附着胞的分化等过程[8]，在稻瘟病菌生长发育及致病过程中具有重要的作用。本研究室在前期研究中鉴定和克隆到8个稻瘟病菌的RGS基因(MoRGS18) [9]。对这些基因进行生物学功能分析发现，RGS基因在稻瘟病菌无性繁殖、有性生殖、致病性，胞外漆酶和过氧化物酶活性、细胞壁完整性过程中具有重要的调控作用[9]。但是，这些蛋白调控这一系列生物学表型的分子机制尚不清楚。本文将采用原核表达方法诱导获得这些基因的纯蛋白，试图解析这些蛋白的晶体结构，从而揭示其在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的分子调控机制。研究结果对阐明稻瘟病菌的致病分子机理具有重要的理论意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1. 1. 1 仪器与试剂
真核TA 克隆试剂盒；XhoI、EcoRI、SacI和HindIII等限制性内切酶；PCR仪。
1．1．2 供试质粒及菌株
供试质粒是pET32a，供试菌株为稻瘟病菌野生型菌株Guy11，以及大肠杆菌DH5α和BL21。
1．1．3 菌株培养条件
供试菌株稻瘟病菌野生型菌株Guy11采用滤纸片法保存于20℃；野生型菌株Guy11在28℃条件下培养于完全培养基(CM)[13]。大肠杆菌菌株DH5α，BL21均接种于LB培养基中，37℃条件下培养。
1．2 方法
1．2．1 原核表达载体的片段扩增
利用引物分别进行PCR扩增得到MoRGS18基因片段并纯化回收。
引物编号
引物序列
MoRGS1
32aFEcoRI:GAATTCCGCATGGACAAGATCCTGAAC
32aRHindIII:AAGCTTGGAGTAGATGCTCGTACCTGCG
MoRGS2
32aFEcoRI:GAATTCACGCTACAGGAAATACTTGCC
32aRHindIII:AAGCTTGGTCATACTCTGAAAGGTGCATC
MoRGS3
32aFEcoRI:GAATTCTCGCCTCAACCCGACATAAC
32aRXhoI:CTCGAGTGATAAGGTTTCCCAAAGCCTTCAT
MoRGS4
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