水稻白叶枯病菌pxo99a中非编码小rnatrans3747的鉴定与功能分析
细菌非编码小RNA (small non-coding RNA, sRNA)是一类长度约为50~500bp的单链RNA分子，在转录后水平参与调控细菌的各种生理过程和应激反应。在植物细菌性病害中，水稻白叶枯病是一种重要的水稻病害，由稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)引起。目前，Xoo中参与致病性调控的sRNA分子还有待挖掘。课题组前期通过高通量测序对比Xoo在致病相关基因诱导培养基XOM2和普通生长培养基PSA中表达的sRNA，获得了10个差异表达的sRNA分子。本课题选取其中一个sRNA分子trans3747为研究对象，通过表达分析确定了该sRNA在XOM2中下调表达。构建了trans3747的缺失突变体，研究发现该突变体生长速率相对于野生型有所减慢；在PSA中, hrp基因簇调控基因hrpG和hrpX在突变体和野生型中无表达差异，而在XOM2中，hrpG在trans3747缺失条件下表达显著上调，该结果说明，tran3747可能作为hrp基因簇的负调控因子参与Xoo致病力的调控。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstracts 1
Keywords 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 供试菌株和质粒 2
1．1．1 菌株和质粒 2
1.1.2 菌株培养条件及保存 2
1.2 培养基和抗生素 3
1.2.1 培养基 3
1.2.2 抗生素 3
1.3 试验试剂及器材 4
1.3.1 试剂 4
1.3.2 器材 4
2 方法 4
2.1 trans3747缺失突变体载体的构建 4
2.1.1 引物设计与合成 4
2.1.2 PXO99A基因组DNA的提取 4
2.1.3 PCR扩增trans3747上下游片段 4
2.1.4 DNA纯化 5
2.1.5 连接和转化 5
2.1.5.1 大肠杆菌（E.coli DH5α）感受态的制备 5
2.1. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
5.2 连接产物的热激转化 6
2.1.5.3 质粒的提取 6
2.1.5.4 酶切反应 6
2.1.5.5 片段连接 7
2.2 PXO99A、trans3747缺失突变体菌株的获得 7
2.2.1 PXO99A感受态的制备 7
2.2.2 PXO99A感受态细胞的转化 7
2.2.3 菌落PCR验证 8
2.3 trans3747突变菌株生长速率的测定 8
2.4 基因表达量分析 8
2.4.1 PXO99A菌种收集 8
2.4.2 菌体RNA的提取 9
2.4.3 反转录RTPCR 9
2.4.3.1 去除RNA中的DNA 9
2.4.3.2 cDNA第一链合成 9
2.4.3.3 qRTPCR 10
3 结果与分析 10
3.1 trans3747在基因组的位置信息及其靶基因的预测 10
3.2 trans3747在hrp基因诱导培养基中表达下调 11
3.3 trans3747缺失突变体的构建情况 11
3.3.1 PXO99A中trans3747单交换突变体的筛选 12
3.3.2 PXO99A中trans3747双交换突变体的筛选 12
3.4 trans3747敲除突变体的生长情况 12
3.5 trans3747突变体中hrp基因簇相关基因的表达情况 13
4 讨论 14
致谢 14
参考文献 15
水稻白叶枯病菌PXO99A中非编码小RNA trans3747的鉴定与功能分析
引言
引言
水稻白叶枯病是我国乃至全世界重要的水稻病害之一，最早于1884年在日本福冈县发现。在我国，目前除新疆以外，各省（市、自治区）均有发生，但以华东、华中和华南稻区发生普遍，危害较重。水稻受害后，叶片干枯，瘪谷增多，千粒重降低，一般减产20%~30%，严重的减产50%以上，甚至颗粒无收[1]。为了预防或降低水稻白叶枯病的发生率，全面揭示水稻白叶枯病菌的致病机制成为当下重要课题。
水稻白叶枯病菌的致病性主要由Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system, T3SS)加以控制，病菌在侵染水稻后，通过T3SS向植物细胞分泌效应蛋白(Effector proteins) [2] [3]。由于T3SS是病原菌与寄主互作的关键，通过T3SS组分的表达，细菌建立起一条将致病效应蛋白(effector)传递到寄主细胞的通道，从而启动侵染过程。而T3SS主要由 hrp(Hypersensitive response and pathogenicity)基因簇编码，有研究分析表明，许多hrp基因产物是泌出需要的，该基因决定了植物病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病寄主过敏性反应[4]。同时，在致病过程或者过敏性反应的T3SS组分表达过程中，逐渐发现了sRNA的重要调控作用。这就使人们认识到原核生物的sRNA对基因表达调控的重大意义，尤其sRNA的鉴定和功能研究对完善植物病原细菌致病性调控网络十分重要[5]。
sRNA是一类长度为50~500nt的核苷酸，在基因组中被转录但是不编码蛋白质的一类RNA分子，转录通常开始于一段能折叠成稳定茎环结构的序列，终止于一个Rho不依赖的转录终止子[6]。大多数sRNA位于2个蛋白编码基因之间的非编码区，即阅读框(open reading frame，ORF)之间。还有一些sRNA是从mRNA的5或3非转译区域剪切下来的。广泛存在于各种细菌染色体上，少部分存在于质粒、噬菌体或转座子上[7]。
目前相关的功能研究成果多报道于动物病原细菌领域，植物病原菌中鲜有报道，尤其是水稻白叶枯病菌中Xoo中的sRNA的研究成果少之又少。先前在Xoo. Str. PXO99A中利用生物信息学预测和鸟枪克隆法鉴定出了8个sRNAs，这些sRNA可能参与了氨基酸代谢和运输过程，影响蛋白质的丰度，参与DNA复制、核糖体RNA加工和新陈代谢过程。然而，对比sRNA突变菌株和野生型菌株，没有表型差别，毒性相似，并未发现与细菌致病性有直接的关系[8]。
本课题组前期通过高通量测序的方法，对比了在hrp基因诱导培养基XOM2（模拟侵染植物的环境）和普通生长培养基PSA中表达的sRNA，筛选了出了10个差异表达的sRNA，本课题则选取了其中之一的低表达的trans3747为研究对象，构建了trans3747基因的缺失突变体(Δtrans3747)，并对trans3747缺失突变体的生长情况以及hrp基因簇基因的表达情况进行了分析。以此，对水稻白叶枯病菌Xoo PXO99A中参与毒力基因表达的一个sRNA分子trans3747进行全面的挖掘和功能分析，丰富致病性调控网络，了解细菌致病分子机理，为水稻白叶枯病的防治提供新的思路和理论依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstracts 1
Keywords 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 供试菌株和质粒 2
1．1．1 菌株和质粒 2
1.1.2 菌株培养条件及保存 2
1.2 培养基和抗生素 3
1.2.1 培养基 3
1.2.2 抗生素 3
1.3 试验试剂及器材 4
1.3.1 试剂 4
1.3.2 器材 4
2 方法 4
2.1 trans3747缺失突变体载体的构建 4
2.1.1 引物设计与合成 4
2.1.2 PXO99A基因组DNA的提取 4
2.1.3 PCR扩增trans3747上下游片段 4
2.1.4 DNA纯化 5
2.1.5 连接和转化 5
2.1.5.1 大肠杆菌（E.coli DH5α）感受态的制备 5
2.1. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
5.2 连接产物的热激转化 6
2.1.5.3 质粒的提取 6
2.1.5.4 酶切反应 6
2.1.5.5 片段连接 7
2.2 PXO99A、trans3747缺失突变体菌株的获得 7
2.2.1 PXO99A感受态的制备 7
2.2.2 PXO99A感受态细胞的转化 7
2.2.3 菌落PCR验证 8
2.3 trans3747突变菌株生长速率的测定 8
2.4 基因表达量分析 8
2.4.1 PXO99A菌种收集 8
2.4.2 菌体RNA的提取 9
2.4.3 反转录RTPCR 9
2.4.3.1 去除RNA中的DNA 9
2.4.3.2 cDNA第一链合成 9
2.4.3.3 qRTPCR 10
3 结果与分析 10
3.1 trans3747在基因组的位置信息及其靶基因的预测 10
3.2 trans3747在hrp基因诱导培养基中表达下调 11
3.3 trans3747缺失突变体的构建情况 11
3.3.1 PXO99A中trans3747单交换突变体的筛选 12
3.3.2 PXO99A中trans3747双交换突变体的筛选 12
3.4 trans3747敲除突变体的生长情况 12
3.5 trans3747突变体中hrp基因簇相关基因的表达情况 13
4 讨论 14
致谢 14
参考文献 15
水稻白叶枯病菌PXO99A中非编码小RNA trans3747的鉴定与功能分析
引言
引言
水稻白叶枯病是我国乃至全世界重要的水稻病害之一，最早于1884年在日本福冈县发现。在我国，目前除新疆以外，各省（市、自治区）均有发生，但以华东、华中和华南稻区发生普遍，危害较重。水稻受害后，叶片干枯，瘪谷增多，千粒重降低，一般减产20%~30%，严重的减产50%以上，甚至颗粒无收[1]。为了预防或降低水稻白叶枯病的发生率，全面揭示水稻白叶枯病菌的致病机制成为当下重要课题。
水稻白叶枯病菌的致病性主要由Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system, T3SS)加以控制，病菌在侵染水稻后，通过T3SS向植物细胞分泌效应蛋白(Effector proteins) [2] [3]。由于T3SS是病原菌与寄主互作的关键，通过T3SS组分的表达，细菌建立起一条将致病效应蛋白(effector)传递到寄主细胞的通道，从而启动侵染过程。而T3SS主要由 hrp(Hypersensitive response and pathogenicity)基因簇编码，有研究分析表明，许多hrp基因产物是泌出需要的，该基因决定了植物病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病寄主过敏性反应[4]。同时，在致病过程或者过敏性反应的T3SS组分表达过程中，逐渐发现了sRNA的重要调控作用。这就使人们认识到原核生物的sRNA对基因表达调控的重大意义，尤其sRNA的鉴定和功能研究对完善植物病原细菌致病性调控网络十分重要[5]。
sRNA是一类长度为50~500nt的核苷酸，在基因组中被转录但是不编码蛋白质的一类RNA分子，转录通常开始于一段能折叠成稳定茎环结构的序列，终止于一个Rho不依赖的转录终止子[6]。大多数sRNA位于2个蛋白编码基因之间的非编码区，即阅读框(open reading frame，ORF)之间。还有一些sRNA是从mRNA的5或3非转译区域剪切下来的。广泛存在于各种细菌染色体上，少部分存在于质粒、噬菌体或转座子上[7]。
目前相关的功能研究成果多报道于动物病原细菌领域，植物病原菌中鲜有报道，尤其是水稻白叶枯病菌中Xoo中的sRNA的研究成果少之又少。先前在Xoo. Str. PXO99A中利用生物信息学预测和鸟枪克隆法鉴定出了8个sRNAs，这些sRNA可能参与了氨基酸代谢和运输过程，影响蛋白质的丰度，参与DNA复制、核糖体RNA加工和新陈代谢过程。然而，对比sRNA突变菌株和野生型菌株，没有表型差别，毒性相似，并未发现与细菌致病性有直接的关系[8]。
本课题组前期通过高通量测序的方法，对比了在hrp基因诱导培养基XOM2（模拟侵染植物的环境）和普通生长培养基PSA中表达的sRNA，筛选了出了10个差异表达的sRNA，本课题则选取了其中之一的低表达的trans3747为研究对象，构建了trans3747基因的缺失突变体(Δtrans3747)，并对trans3747缺失突变体的生长情况以及hrp基因簇基因的表达情况进行了分析。以此，对水稻白叶枯病菌Xoo PXO99A中参与毒力基因表达的一个sRNA分子trans3747进行全面的挖掘和功能分析，丰富致病性调控网络，了解细菌致病分子机理，为水稻白叶枯病的防治提供新的思路和理论依据。
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