大丽轮枝菌突变体6c4中突变基因的鉴定和初步分析
本研究以江苏典型的落叶型棉花黄萎病菌株 V07DF2为出发菌株，通过农杆菌介导的转化方法获得了T-DNA插入突变体库。在1000个随机选择的转化子筛选完成的基础上，我们获得了一个称为6C4的在磷酸盐缺陷培养基上生长显著减缓的突变体材料，并且Southern杂交的结果表明，该突变体为单拷贝插入突变。在获得了T-DNA插入位点的侧翼序列后，我们在DNA和RNA水平分别验证了其可靠性和准确性。根据基因组数据库中的序列信息，设计并构建了同源重组敲除质粒，利用同源重组原理，获得了野生型菌株的定点敲除突变体NUC-2Δ5和NUC-2Δ14。经过磷酸盐缺陷平板验证，敲除突变体和6C4在表型上完全一致，说明6C4中基因VdNUC-2被突变就是造成其在磷酸盐缺陷培养基上不能正常生长的原因。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1质粒与菌株 3
1.1.2培养基和培养条件3
1.1.3抗生素等其它溶液的配制4
1.2方法 4
1.2.1 RNA取4
1.2.2大丽轮枝菌gDNA提取方法5
1.2.3热激转化法转化大肠杆菌5
1.2.4 ATMT法转化大丽轮枝菌菌株 6
1.2.5通过PCR和半定量PCR验证大丽轮枝菌致病力丧失突变体6C4的插入位点和其突变基因的表达情况6
1.2.6 将野生菌VO7DF2敲除6C4对应基因VdSUN26
2实验结果7
2.1 验证大丽轮枝菌致病力丧失突变体6C4的插入位点和其突变基因7
2.2对野生菌V07DF2定点基因敲除，比较敲除后的菌物生长形态与突变体6C4的差异
8
3讨论 9
致谢10
参考文献10
大丽轮枝菌突变体6C4中突变基因的鉴定和初步分析
引言
引言：在世界各地的棉区中，棉花黄萎病（Cotton Verticillium Wilt）是一种发生普遍的棉花病害，现已成为影响棉花产 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
量的主要原因之一[1]。棉花黄萎病为土传维管束病害，防治困难，难以找到很好的抗源材料，因而多年来一直未能培育出高抗黄萎病的棉花新品种，研究开发的病害防治方法和药剂亦难以达到理想的防治效果。
黄萎病的病原菌在分类学上属半知菌亚门（Deuteromycotina）、淡色孢（Moliliaceae）、轮枝菌属（Verticillium）。在轮枝菌属中有 2 个种可以引起棉花黄萎病，分别是大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）和黑白轮枝菌（Verticillium alboatrum Reinke & Berthold）[2]。我国产棉区的棉花黄萎病菌主要为大丽轮枝菌[3]。自然界中，大丽轮枝菌缺乏有性生殖的过程，其遗传物质的交换主要是通过菌丝融合、异核现象及准性生殖完成，从而产生菌株形态和致病力的差异性[5,6]。
一般棉花黄萎病的症状包括：萎蔫、褪绿、黄化、组织坏死、生长迟缓和导管褐化，在不同的发病阶段，棉花则会表现出相应的病症[4]。另外，棉花黄萎病在田间的症状有时表现为多数或全株叶片萎蔫下垂，夏季暴雨过后有时也会出现急性青萎，病叶似开水烫伤状萎焉，后转褐色枯死，叶片向上卷曲成勺状，很快脱落成光杆。秋季重病株下部叶片脱落严重，仅在顶端残留少量小叶，蕾铃稀少。刨视茎杆，可见木质部导管变褐，但较枯萎病株的色浅[7]。大丽轮枝菌（V. dahliae）作为一种土传植物病原真菌，能够在广泛的宿主中寄生并引起黄萎病。在土壤中大丽轮枝菌以微菌核的形式存在，该形态为一种休眠状态，微菌核为其休眠体[12]。当环境中有植物根系分泌物扩散时，受其诱导微菌核开始萌发成菌丝，菌丝向着植物根系的方向生长，附着到植物根系，突破表皮，进入皮层，到达维管束，并开始向上定殖，最终导致植物发病[13]。菌丝进入维管束，利用其中的营养物质产生大量孢子，并随着寄主的蒸腾作用向上扩展，从而侵入到寄主的茎部和叶片，最终定殖到整个寄主[14]。整个侵染阶段的完成需要许多基因的互作和配合，但目前对大丽轮枝菌致病基因的报道都是集中在单个基因的研究，对于大丽轮枝菌致病的整个信号通路却还未有宏观的研究。
农杆菌是土壤中的一种革兰氏阴性细菌，感染寄主后，在侵染部位会形成冠瘿瘤，诱发根癌病，这是由农杆菌Ti质粒上的毒性区（Vir区）和TDNA引起的[8]。虽然真菌不是农杆菌的天然寄主，但在实验室条件下，经过诱导物乙酰丁香酮(AS) 作用, 农杆菌可将其TDNA整合到真菌染色体组并表达[9]。TDNA整合到真菌基因组有两种方式：TDNA与寄主基因组有同源序列时，进行同源重组；没有同源序列时，进行异源重组，TDNA随机插入。农杆菌介导的遗传转化（ATMT）以其高效的转化率和广泛的受体种类得到迅速发展，通过ATMT方法成功进行真菌转化的报道逐年增多[11]。目前，大丽轮枝菌的基因功能组研究仍处于基础阶段，结合已公布的部分基因组序列信息，利用ATMT方法进行大规模随机和定点突变，能更全面的覆盖整个基因组，高效揭示其代谢调控过程中各基因的功能。目前，农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation，
ATMT）已经被成功用于大丽轮枝菌的遗传转化、基因定点突变和功能研究。
材料与方法
1.1 材料与培养基的配制
1.1.1 质粒与菌株
表达载体构建所用的出发质粒为pAHygOSCAR质粒，含有潮霉素抗性基因。遗传转化所用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株 AGL1；强致病力、落叶型棉花黄萎菌（Verticillium dahliae Kleb.）菌株V07DF2；以及致病能力减弱、菌体表型较为突出的突变体菌株6c4。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1质粒与菌株 3
1.1.2培养基和培养条件3
1.1.3抗生素等其它溶液的配制4
1.2方法 4
1.2.1 RNA取4
1.2.2大丽轮枝菌gDNA提取方法5
1.2.3热激转化法转化大肠杆菌5
1.2.4 ATMT法转化大丽轮枝菌菌株 6
1.2.5通过PCR和半定量PCR验证大丽轮枝菌致病力丧失突变体6C4的插入位点和其突变基因的表达情况6
1.2.6 将野生菌VO7DF2敲除6C4对应基因VdSUN26
2实验结果7
2.1 验证大丽轮枝菌致病力丧失突变体6C4的插入位点和其突变基因7
2.2对野生菌V07DF2定点基因敲除，比较敲除后的菌物生长形态与突变体6C4的差异
8
3讨论 9
致谢10
参考文献10
大丽轮枝菌突变体6C4中突变基因的鉴定和初步分析
引言
引言：在世界各地的棉区中，棉花黄萎病（Cotton Verticillium Wilt）是一种发生普遍的棉花病害，现已成为影响棉花产 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
量的主要原因之一[1]。棉花黄萎病为土传维管束病害，防治困难，难以找到很好的抗源材料，因而多年来一直未能培育出高抗黄萎病的棉花新品种，研究开发的病害防治方法和药剂亦难以达到理想的防治效果。
黄萎病的病原菌在分类学上属半知菌亚门（Deuteromycotina）、淡色孢（Moliliaceae）、轮枝菌属（Verticillium）。在轮枝菌属中有 2 个种可以引起棉花黄萎病，分别是大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）和黑白轮枝菌（Verticillium alboatrum Reinke & Berthold）[2]。我国产棉区的棉花黄萎病菌主要为大丽轮枝菌[3]。自然界中，大丽轮枝菌缺乏有性生殖的过程，其遗传物质的交换主要是通过菌丝融合、异核现象及准性生殖完成，从而产生菌株形态和致病力的差异性[5,6]。
一般棉花黄萎病的症状包括：萎蔫、褪绿、黄化、组织坏死、生长迟缓和导管褐化，在不同的发病阶段，棉花则会表现出相应的病症[4]。另外，棉花黄萎病在田间的症状有时表现为多数或全株叶片萎蔫下垂，夏季暴雨过后有时也会出现急性青萎，病叶似开水烫伤状萎焉，后转褐色枯死，叶片向上卷曲成勺状，很快脱落成光杆。秋季重病株下部叶片脱落严重，仅在顶端残留少量小叶，蕾铃稀少。刨视茎杆，可见木质部导管变褐，但较枯萎病株的色浅[7]。大丽轮枝菌（V. dahliae）作为一种土传植物病原真菌，能够在广泛的宿主中寄生并引起黄萎病。在土壤中大丽轮枝菌以微菌核的形式存在，该形态为一种休眠状态，微菌核为其休眠体[12]。当环境中有植物根系分泌物扩散时，受其诱导微菌核开始萌发成菌丝，菌丝向着植物根系的方向生长，附着到植物根系，突破表皮，进入皮层，到达维管束，并开始向上定殖，最终导致植物发病[13]。菌丝进入维管束，利用其中的营养物质产生大量孢子，并随着寄主的蒸腾作用向上扩展，从而侵入到寄主的茎部和叶片，最终定殖到整个寄主[14]。整个侵染阶段的完成需要许多基因的互作和配合，但目前对大丽轮枝菌致病基因的报道都是集中在单个基因的研究，对于大丽轮枝菌致病的整个信号通路却还未有宏观的研究。
农杆菌是土壤中的一种革兰氏阴性细菌，感染寄主后，在侵染部位会形成冠瘿瘤，诱发根癌病，这是由农杆菌Ti质粒上的毒性区（Vir区）和TDNA引起的[8]。虽然真菌不是农杆菌的天然寄主，但在实验室条件下，经过诱导物乙酰丁香酮(AS) 作用, 农杆菌可将其TDNA整合到真菌染色体组并表达[9]。TDNA整合到真菌基因组有两种方式：TDNA与寄主基因组有同源序列时，进行同源重组；没有同源序列时，进行异源重组，TDNA随机插入。农杆菌介导的遗传转化（ATMT）以其高效的转化率和广泛的受体种类得到迅速发展，通过ATMT方法成功进行真菌转化的报道逐年增多[11]。目前，大丽轮枝菌的基因功能组研究仍处于基础阶段，结合已公布的部分基因组序列信息，利用ATMT方法进行大规模随机和定点突变，能更全面的覆盖整个基因组，高效揭示其代谢调控过程中各基因的功能。目前，农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation，
ATMT）已经被成功用于大丽轮枝菌的遗传转化、基因定点突变和功能研究。
材料与方法
1.1 材料与培养基的配制
1.1.1 质粒与菌株
表达载体构建所用的出发质粒为pAHygOSCAR质粒，含有潮霉素抗性基因。遗传转化所用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株 AGL1；强致病力、落叶型棉花黄萎菌（Verticillium dahliae Kleb.）菌株V07DF2；以及致病能力减弱、菌体表型较为突出的突变体菌株6c4。
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