水稻osppkl1与adg1的相互作用研究
：PP2A 蛋白磷酸酶OsPPKL1控制水稻籽粒长度。为了研究OsPPKL1调控水稻粒长的机制，利用酵母双杂交的技术筛选了OsPPKL1互作蛋白，以期望可以进一步阐明OsPPKL1的作用机理。从互作蛋白中挑选了一个编码腺苷酸激酶的基因ADG1（LOC_Os12g13380） 进行了进一步验证。为了进一步确定OsPPKL1和ADG1的互作，利用双分子荧光互补技术BiFC进一步验证，构建了OsPPKL1和ADG1的BiFC的载体，通过注射烟草的方法研究了二者的互作情况。利用qRT-PCR的技术研究ADG1在93-11不同组织内的表达情况。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1植物材料4
1.1.2 菌株、载体和试剂盒4
1.2方法 5
1.2.1酵母双杂交钓饵载体的构建5
1.2.2酵母感受态细胞制备和转化5
1.2.3βgalactosidase活性检测5
1.2.4双分子荧光互补（BiFC）载体的构建6
1.2.5农杆菌转化法6
1.2.6烟草注射6
1.2.7水稻幼苗总RNA的提取6
1.2.8总 RNA完整性检测7
1.2.9 cDNA 第一链的合成7
1.2.10 Realtime PCR7
2结果与分析7
2.1 OsPPKL1与ADG1的酵母双杂交结果分析7
2.2烟草BiFC结果分析8
2.3 realtime PCR结果分析9
3讨论 10
参考文献11
水稻OsPPKL1与ADG1的相互作用研究
引言
引言
水稻的单株产量是由穗数、每穗粒数和粒重三个因素共同决定的，其中粒重是由籽粒大小和灌浆程度共同决定。在灌浆程度理想的情况下，水稻的粒重可以直观地认为由水稻的籽粒大小决定。水稻籽粒的大小从外观上可以细分为籽粒长度、宽度和厚度三个组分，遗传上受数量
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
性状基因座（QTLs, quantitative trait loci）控制，有较高的遗传率。水稻籽粒的长、宽、厚直接关系到水稻的籽粒大小，同时又决定着水稻的长宽比等外观品质性状，因而，对单子叶分子生物学研究的模式植物—水稻的粒形和粒重研究具有重要理论和实践意义。
贾小丽等[1]检测到16个控制粒长进行数量性状的基因位点(QTL)定位及环境互作分析。结果检测到16个控制粒长的加性QTL,包括在武夷山检测到的7个QTL和在莆田检测到的9个QTL。它们分布在1、2、4、5、6、7、10、11、12号染色体上，其中有2个QTL在环境下被重复检出。林荔辉等[2]以2个籼稻品种H359和Acc8558为亲本组建重组自交系，结果检测到15个粒长相关的QTL,分布于2、3、4、7、8、10、11号染色体上，可解释75%的表形变异。曾瑞珍等[3]一单片段代换系为材料构建遗传群体，粒长QTLgl3被定位于第3染色体着丝粒附近的SSR标记RM6146于PSM377之间，遗传距离分别为1.5cM和11.0cM。赵明富等[4]以小粒博白B与大粒WFC为亲本构建长粒近等基因系，发现了一个长粒对短粒显性的主效应QTL。研究表明立场相关QTL位于第2号染色体，与分子标记RM530连锁，遗传距离为4.1cM，是未曾报道的粒长显形主效QTL。Tan等[5]在以Shanyou63的亲本杂交得到的F2、F3群体以及F10重组自交系中发现粒长相关的主效QTL是位于第3号染色体，贡献率高达40%以上。研究不同环境条件下水稻粒长的QTL定位，对粒长分子辅助选择具有重要参考作用。邢永忠等[6]对水稻‘珍汕97’和‘明恢63’组合的重组自交系的粒长形状进行了基因定位，2年共检测到9个相关的加性QTL，分布于1、3、9、11染色体上，位于第3染色体上的gl3b两年的贡献率分别为57.5%和61.4%。姜树坤等[7]利用Nipponbare（粳）/Kasalath(籼)//Nipponbare（粳）的98个BC1F5回交重组自交系群体以及包含245个分子标记的连锁图谱，与2009年和2010年分别在日本筑波和中国沈阳对水稻粒长性状进行数量性状基因位点（Quantitative trait loic，QTL）分析，结果共检测到6个控制粒长的QTL，分布于1、3、6、10、12染色体，对表型变异贡献率达10%以上。
本实验室利用超大粒粳稻材料N411（千粒重72.13±2.32 g）与小粒籼稻材料N643（千粒重17.80±0.82 g）构建的F2 群体，进行了水稻籽粒及穗部性状的QTL 定位研究（Zhang 等, 2012)。发现位于第3 染色体的RM6266 与RM3350 之间存在一个同时控制粒长、粒宽、粒厚、粒重和穗长的新位点qGL3。利用新开发的InDel 标记对2968个个体构成的大分离群体N411×9311 BC2F3 中获得的重组个体进行重组位点的高精度分析，结合后代的表型测验，最终将qGL3 定位在InDel 标记XJ39 与XJ26 之间的46.6 kb 的范围之内。在这一区间内，鉴定出唯一亲本间有差异的候选基因ORF4（LOC_Os03g44500）。ORF4 编码一个含有两个Kelch 结构域的PP2A 蛋白磷酸酶（OsPPKL1）。来自9311 和N411 不同等位基因的转基因研究结果表明，在中花11 中过量表达OsPPKL19311 引起水稻籽粒的变短，而过表达OsPPKL1N411 并不会引起籽粒的明显变化，说明等位基因OsPPKL1N411 丢失了OsPPKL19311 的负调控功能，进而形成了较长的籽粒。对OsPPKL19311 的Kelch 和PP2A 功能域的分别过表达转基因发现，单独过表达Kelch9311引起籽粒的明显变短，而单独过表达PP2A9311 不会引起籽粒的变化，表明OsPPKL19311中的Kelch 结构域OsPPKL19311发挥负调控功能的关键结构域（Zhang et al., 2012)。为了研究OsPPKL1调控水稻粒长的机制，我们进行了酵母双杂交实验和BiFC技术用于确定OsPPKL1的作用底物。
1 材料与方法
材料
1.1.1植物材料
实验所用的水稻粳稻品种（Oryza sativa L.sub Japoncia）中花11由本实验室提供。使用0.3%次氯酸钠将水稻种子处理15 min，30℃催芽至种子露白，然后将种子播于96孔板中，于人工气候培养箱（16 h光照/8 h黑暗，白天30℃夜晚26℃）中水培生长，营养液采用国际水稻所常规营养液配方。待幼苗生长至34叶期时，继续于培养箱中连续光照，28℃培养两天后进行各种处理。
1.1.2 菌株、载体和试剂盒
DH5, AH109,农杆菌，胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒
基因克隆中间载体 pMB18T Simple Vector，购买自 TaKaRa。
pEASY T1 Simple Cloning Kit，用于载体构建的中间载体，购买自全式金。
过表达载体：pCAMBIA1300S，本实验室保存。
启动子活性检测载体：pCAMBIA1304。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1植物材料4
1.1.2 菌株、载体和试剂盒4
1.2方法 5
1.2.1酵母双杂交钓饵载体的构建5
1.2.2酵母感受态细胞制备和转化5
1.2.3βgalactosidase活性检测5
1.2.4双分子荧光互补（BiFC）载体的构建6
1.2.5农杆菌转化法6
1.2.6烟草注射6
1.2.7水稻幼苗总RNA的提取6
1.2.8总 RNA完整性检测7
1.2.9 cDNA 第一链的合成7
1.2.10 Realtime PCR7
2结果与分析7
2.1 OsPPKL1与ADG1的酵母双杂交结果分析7
2.2烟草BiFC结果分析8
2.3 realtime PCR结果分析9
3讨论 10
参考文献11
水稻OsPPKL1与ADG1的相互作用研究
引言
引言
水稻的单株产量是由穗数、每穗粒数和粒重三个因素共同决定的，其中粒重是由籽粒大小和灌浆程度共同决定。在灌浆程度理想的情况下，水稻的粒重可以直观地认为由水稻的籽粒大小决定。水稻籽粒的大小从外观上可以细分为籽粒长度、宽度和厚度三个组分，遗传上受数量
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
性状基因座（QTLs, quantitative trait loci）控制，有较高的遗传率。水稻籽粒的长、宽、厚直接关系到水稻的籽粒大小，同时又决定着水稻的长宽比等外观品质性状，因而，对单子叶分子生物学研究的模式植物—水稻的粒形和粒重研究具有重要理论和实践意义。
贾小丽等[1]检测到16个控制粒长进行数量性状的基因位点(QTL)定位及环境互作分析。结果检测到16个控制粒长的加性QTL,包括在武夷山检测到的7个QTL和在莆田检测到的9个QTL。它们分布在1、2、4、5、6、7、10、11、12号染色体上，其中有2个QTL在环境下被重复检出。林荔辉等[2]以2个籼稻品种H359和Acc8558为亲本组建重组自交系，结果检测到15个粒长相关的QTL,分布于2、3、4、7、8、10、11号染色体上，可解释75%的表形变异。曾瑞珍等[3]一单片段代换系为材料构建遗传群体，粒长QTLgl3被定位于第3染色体着丝粒附近的SSR标记RM6146于PSM377之间，遗传距离分别为1.5cM和11.0cM。赵明富等[4]以小粒博白B与大粒WFC为亲本构建长粒近等基因系，发现了一个长粒对短粒显性的主效应QTL。研究表明立场相关QTL位于第2号染色体，与分子标记RM530连锁，遗传距离为4.1cM，是未曾报道的粒长显形主效QTL。Tan等[5]在以Shanyou63的亲本杂交得到的F2、F3群体以及F10重组自交系中发现粒长相关的主效QTL是位于第3号染色体，贡献率高达40%以上。研究不同环境条件下水稻粒长的QTL定位，对粒长分子辅助选择具有重要参考作用。邢永忠等[6]对水稻‘珍汕97’和‘明恢63’组合的重组自交系的粒长形状进行了基因定位，2年共检测到9个相关的加性QTL，分布于1、3、9、11染色体上，位于第3染色体上的gl3b两年的贡献率分别为57.5%和61.4%。姜树坤等[7]利用Nipponbare（粳）/Kasalath(籼)//Nipponbare（粳）的98个BC1F5回交重组自交系群体以及包含245个分子标记的连锁图谱，与2009年和2010年分别在日本筑波和中国沈阳对水稻粒长性状进行数量性状基因位点（Quantitative trait loic，QTL）分析，结果共检测到6个控制粒长的QTL，分布于1、3、6、10、12染色体，对表型变异贡献率达10%以上。
本实验室利用超大粒粳稻材料N411（千粒重72.13±2.32 g）与小粒籼稻材料N643（千粒重17.80±0.82 g）构建的F2 群体，进行了水稻籽粒及穗部性状的QTL 定位研究（Zhang 等, 2012)。发现位于第3 染色体的RM6266 与RM3350 之间存在一个同时控制粒长、粒宽、粒厚、粒重和穗长的新位点qGL3。利用新开发的InDel 标记对2968个个体构成的大分离群体N411×9311 BC2F3 中获得的重组个体进行重组位点的高精度分析，结合后代的表型测验，最终将qGL3 定位在InDel 标记XJ39 与XJ26 之间的46.6 kb 的范围之内。在这一区间内，鉴定出唯一亲本间有差异的候选基因ORF4（LOC_Os03g44500）。ORF4 编码一个含有两个Kelch 结构域的PP2A 蛋白磷酸酶（OsPPKL1）。来自9311 和N411 不同等位基因的转基因研究结果表明，在中花11 中过量表达OsPPKL19311 引起水稻籽粒的变短，而过表达OsPPKL1N411 并不会引起籽粒的明显变化，说明等位基因OsPPKL1N411 丢失了OsPPKL19311 的负调控功能，进而形成了较长的籽粒。对OsPPKL19311 的Kelch 和PP2A 功能域的分别过表达转基因发现，单独过表达Kelch9311引起籽粒的明显变短，而单独过表达PP2A9311 不会引起籽粒的变化，表明OsPPKL19311中的Kelch 结构域OsPPKL19311发挥负调控功能的关键结构域（Zhang et al., 2012)。为了研究OsPPKL1调控水稻粒长的机制，我们进行了酵母双杂交实验和BiFC技术用于确定OsPPKL1的作用底物。
1 材料与方法
材料
1.1.1植物材料
实验所用的水稻粳稻品种（Oryza sativa L.sub Japoncia）中花11由本实验室提供。使用0.3%次氯酸钠将水稻种子处理15 min，30℃催芽至种子露白，然后将种子播于96孔板中，于人工气候培养箱（16 h光照/8 h黑暗，白天30℃夜晚26℃）中水培生长，营养液采用国际水稻所常规营养液配方。待幼苗生长至34叶期时，继续于培养箱中连续光照，28℃培养两天后进行各种处理。
1.1.2 菌株、载体和试剂盒
DH5, AH109,农杆菌，胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒
基因克隆中间载体 pMB18T Simple Vector，购买自 TaKaRa。
pEASY T1 Simple Cloning Kit，用于载体构建的中间载体，购买自全式金。
过表达载体：pCAMBIA1300S，本实验室保存。
启动子活性检测载体：pCAMBIA1304。
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