贵阳腐霉杀蚊测定及其侵染过程的初步观察
摘要：众所周知，化学农药对环境的影响正在日益严重，随着人类环境保护意识的增强，寻找一种高效、环保的新型农药成为当务之急。微生物农药以其持效期长、不杀伤天敌、对人畜安全以及不易使昆虫产生抗性等优点，受到越来越多人的关注。贵阳腐霉（Pythium guiyangense）是一种灭蚊真菌，经研究证实它具有灭蚊能力较强、 繁殖速度快、易于人工培养和可移植性强以及对非靶生物相对安全等诸多优点。本课题测试了贵阳腐霉对白纹伊蚊和淡色库蚊的杀虫活性，并通过构建表达贵阳腐霉的绿色荧光蛋白观察菌丝侵染蚊虫的全部过程。结果显示贵阳腐霉对白纹伊蚊和淡色库蚊都具有一定的杀虫活性，可以用于蚊虫的生物防治。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1 培养基的配置4
1.1.2 供试菌株4
1.1.3 供试蚊虫4
1.1.4供试药剂4
1.1.5主要设备4
1.2方法 4
1. 2. 1贵阳腐霉杀蚊生物活性测定4
1. 2. 1.1蚊虫实验室饲养方案4
1. 2.1.2贵阳腐霉对白纹伊蚊的生物活性测定5
1. 2. 1.3贵阳腐霉对淡色库蚊的生物活性测定6
1. 2. 2贵阳腐霉PEG介导的原生质体转化系统6
1. 2. 2．1贵阳腐霉的转化培养6
1. 2. 2. 2贵阳腐霉介导的原生质体转化步骤6
1. 2. 2. 3利用GFP标记的菌丝观察侵染过程7
2 结果分析 7
2. 1实验结果7
2. 1. 1贵阳腐霉对白纹伊蚊的生物活性测定结果7
2. 1. 2贵阳腐霉对淡色库蚊的生物活性测定结果8
2. 1. 3绿色荧光蛋白标记的贵阳腐霉侵染蚊虫过程观察结果8
2.2结果与分析9
2. 2. 1贵阳腐霉对蚊虫生物测定的结果与分析9
2. 2. 2用GFP标记的贵阳腐霉在蚊虫体内的侵染观察结果分析9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
3 讨论9
致谢9
参考文献10
贵阳腐霉杀蚊测定及其侵染过程的初步观察
引言
引言：蚊虫不但骚扰人群，而且是传播疾病最多的医学昆虫。在蚊虫传播的众多疾病中，疟疾、登革热、丝虫病和流行性乙型脑炎等对人类健康造成的威胁最严重，影响面也最广[1]。因此，防治蚊虫对于控制蚊媒病、保护人类健康起着至关重要的作用。到目前为止，灭蚊主要的措施仍然以施放化学农药为主。然而，大量使用化学农药已带来环境污染、生态平衡被破坏以及诱导害虫产生抗药性等严重后果[2]。在公众对环境的关心程度越来越高的今天，减少或替代化学农药使用的治虫方法受到重视和推广，其中生物防治就是比较理想的方法之一。但是与蓬勃发展的农业害虫生物防治相比，无论国内外，医学昆虫的生物防治研究都相对滞后，主要体现在有实用价值的灭蚊微生物种类奇缺。目前能用于灭蚊的细菌只有苏云金杆菌以色列变种(Bacillus thuringiensis var.israelensis， Bti)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus， Bs)。尽管有关真菌侵犯蚊虫的报道非常多[3]，然而，作为真菌灭蚊剂上市的也只有大链壶菌(Lagenidium giganteum)。为了适应在不同生态环境中对蚊虫进行生物防治的需要，开发更多的灭蚊微生物是迫在眉睫的任务。贵阳腐霉(Pythium guiyangenseSu)是1994年在贵阳从蚊幼虫尸体中分离到的一株灭蚊真菌，经过有性和无性生殖阶段的形态鉴定和rDNA碱基序列分析，确认它是一腐霉新种，定名为贵阳腐霉[4]。研究发现该菌灭蚊能力强，易于人工培养[5]，对非靶生物无毒无害[68]，具有应用开发前景。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1培养基的配置
0.8M (mannitol)甘露醇，0.5M CaCl2，0.5M MESKOH（pH 5.7），0.5M KCl， W5 solution，MMg solution；V8/0.5M mannitol(P+0.5M)（液体和固体）, Nutrient V8 Broth & Agar Media (NPB)（液体和固体），V8 agar培养基（PA）
KPYG2培养基：葡萄糖 1.5g/L， 酵母1.0g/L，蛋白胨 1.0g/L，氯化钙 0.075g/L，胆固醇 0.02g/L，玉米油 1g/L
SPE葵花籽培养基配制：1.葵花籽10g，粉碎机粉碎；2.加入ddH2O 100mL，搅拌；3.用4层纱布过滤；4.滤渣加ddH2O 100mL，搅拌再过滤；5.两次滤液混匀补水至体积400mL；6.固体培养基加入琼脂6g；7.高温灭菌。
V8培养基；V8饮料：混合蔬菜汁（水、番茄、胡萝卜、芹菜、甜菜、莴苣、盐、香料）V8 330mL,加入3gCaCo3 ,5000rpm离心510min，取上清液1:9纯水稀释。若固体培养基加入3%琼脂。
1．1．2 供试菌株
用于本研究的贵阳腐霉菌株（Pythium guiyangense Su），由贵阳医学院的苏晓庆教授馈赠
1．1．3 供试蚊虫
白纹伊蚊（Aedes albopictus）和淡色库蚊（Culex pipiens pallens）由江苏省疾病预防控制中心提供，后在本实验室内饲养用于实验。
1．1．4 供试药剂
Rtaq酶：宝生物工程 (大连) 有限公司
高保真酶PrimerSTAR DNA Polymernse：invitrogen公司
DNA快速提取试剂盒：AXYGEN公司
DNA凝胶回收试剂：AXYGEN公司
Pham34载体：宝生物工程 (大连) 有限公司
无内毒素质粒大提试剂盒：TIANGEN公司
其余试剂均为国产分析纯。
1．1．5 主要仪器设备
S1000TM?PCR仪?S1000TM?Thermal?Cycler：北京五业嘉科技有限公司
高速离心机：HC2517，安徽中科中佳科学仪器有限公司
超净工作台:苏净安泰
恒温水浴锅：DK8D，上海精宏
电泳仪:BIORAD产品
凝胶成像系统:Tanon产品
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1 培养基的配置4
1.1.2 供试菌株4
1.1.3 供试蚊虫4
1.1.4供试药剂4
1.1.5主要设备4
1.2方法 4
1. 2. 1贵阳腐霉杀蚊生物活性测定4
1. 2. 1.1蚊虫实验室饲养方案4
1. 2.1.2贵阳腐霉对白纹伊蚊的生物活性测定5
1. 2. 1.3贵阳腐霉对淡色库蚊的生物活性测定6
1. 2. 2贵阳腐霉PEG介导的原生质体转化系统6
1. 2. 2．1贵阳腐霉的转化培养6
1. 2. 2. 2贵阳腐霉介导的原生质体转化步骤6
1. 2. 2. 3利用GFP标记的菌丝观察侵染过程7
2 结果分析 7
2. 1实验结果7
2. 1. 1贵阳腐霉对白纹伊蚊的生物活性测定结果7
2. 1. 2贵阳腐霉对淡色库蚊的生物活性测定结果8
2. 1. 3绿色荧光蛋白标记的贵阳腐霉侵染蚊虫过程观察结果8
2.2结果与分析9
2. 2. 1贵阳腐霉对蚊虫生物测定的结果与分析9
2. 2. 2用GFP标记的贵阳腐霉在蚊虫体内的侵染观察结果分析9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
3 讨论9
致谢9
参考文献10
贵阳腐霉杀蚊测定及其侵染过程的初步观察
引言
引言：蚊虫不但骚扰人群，而且是传播疾病最多的医学昆虫。在蚊虫传播的众多疾病中，疟疾、登革热、丝虫病和流行性乙型脑炎等对人类健康造成的威胁最严重，影响面也最广[1]。因此，防治蚊虫对于控制蚊媒病、保护人类健康起着至关重要的作用。到目前为止，灭蚊主要的措施仍然以施放化学农药为主。然而，大量使用化学农药已带来环境污染、生态平衡被破坏以及诱导害虫产生抗药性等严重后果[2]。在公众对环境的关心程度越来越高的今天，减少或替代化学农药使用的治虫方法受到重视和推广，其中生物防治就是比较理想的方法之一。但是与蓬勃发展的农业害虫生物防治相比，无论国内外，医学昆虫的生物防治研究都相对滞后，主要体现在有实用价值的灭蚊微生物种类奇缺。目前能用于灭蚊的细菌只有苏云金杆菌以色列变种(Bacillus thuringiensis var.israelensis， Bti)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus， Bs)。尽管有关真菌侵犯蚊虫的报道非常多[3]，然而，作为真菌灭蚊剂上市的也只有大链壶菌(Lagenidium giganteum)。为了适应在不同生态环境中对蚊虫进行生物防治的需要，开发更多的灭蚊微生物是迫在眉睫的任务。贵阳腐霉(Pythium guiyangenseSu)是1994年在贵阳从蚊幼虫尸体中分离到的一株灭蚊真菌，经过有性和无性生殖阶段的形态鉴定和rDNA碱基序列分析，确认它是一腐霉新种，定名为贵阳腐霉[4]。研究发现该菌灭蚊能力强，易于人工培养[5]，对非靶生物无毒无害[68]，具有应用开发前景。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1培养基的配置
0.8M (mannitol)甘露醇，0.5M CaCl2，0.5M MESKOH（pH 5.7），0.5M KCl， W5 solution，MMg solution；V8/0.5M mannitol(P+0.5M)（液体和固体）, Nutrient V8 Broth & Agar Media (NPB)（液体和固体），V8 agar培养基（PA）
KPYG2培养基：葡萄糖 1.5g/L， 酵母1.0g/L，蛋白胨 1.0g/L，氯化钙 0.075g/L，胆固醇 0.02g/L，玉米油 1g/L
SPE葵花籽培养基配制：1.葵花籽10g，粉碎机粉碎；2.加入ddH2O 100mL，搅拌；3.用4层纱布过滤；4.滤渣加ddH2O 100mL，搅拌再过滤；5.两次滤液混匀补水至体积400mL；6.固体培养基加入琼脂6g；7.高温灭菌。
V8培养基；V8饮料：混合蔬菜汁（水、番茄、胡萝卜、芹菜、甜菜、莴苣、盐、香料）V8 330mL,加入3gCaCo3 ,5000rpm离心510min，取上清液1:9纯水稀释。若固体培养基加入3%琼脂。
1．1．2 供试菌株
用于本研究的贵阳腐霉菌株（Pythium guiyangense Su），由贵阳医学院的苏晓庆教授馈赠
1．1．3 供试蚊虫
白纹伊蚊（Aedes albopictus）和淡色库蚊（Culex pipiens pallens）由江苏省疾病预防控制中心提供，后在本实验室内饲养用于实验。
1．1．4 供试药剂
Rtaq酶：宝生物工程 (大连) 有限公司
高保真酶PrimerSTAR DNA Polymernse：invitrogen公司
DNA快速提取试剂盒：AXYGEN公司
DNA凝胶回收试剂：AXYGEN公司
Pham34载体：宝生物工程 (大连) 有限公司
无内毒素质粒大提试剂盒：TIANGEN公司
其余试剂均为国产分析纯。
1．1．5 主要仪器设备
S1000TM?PCR仪?S1000TM?Thermal?Cycler：北京五业嘉科技有限公司
高速离心机：HC2517，安徽中科中佳科学仪器有限公司
超净工作台:苏净安泰
恒温水浴锅：DK8D，上海精宏
电泳仪:BIORAD产品
凝胶成像系统:Tanon产品
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