水稻籽粒粉质突变体的基因定位
：水稻是主要的粮食作物，其籽粒中主要贮藏物质淀粉的含量和特性决定了水稻最终的各项品质指标和风味口感，此外淀粉的积累量还会对产量造成影响。故而，对于水稻淀粉的生物合成相关基因的研究具有重要的科学价值和宽广的应用前景。本研究通过MNU对宁粳3号进行诱变处理后得到的籽粒粉质突变体flo21为材料，对该突变体的表型进行观察，筛选，进一步使用基因图位克隆的实验手段对目标基因FLO21进行精细定位。实验结果显示，突变体的胚乳外观不透明，横切面呈粉质，FLO21基因被定位在第二染色体长臂末端38kb区域内。本研究为后期基因预测及测序，以及全面阐述基因的功能奠定基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1材料的获得 5
1.1.1种子发苗方法 5
1.1.2 DNA的提取5
1.1.3 PCR扩增6
1.1.4 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)6
1.1.5 标记筛选及定位7
1.2 确定突变位点8
1.2.1 RNA提取8
1.2.2 RNA反转录扩增cDNA8
1.2.3利用KOD酶扩增基因9
1.2.4 琼脂糖电泳检测9
1.2.5 琼脂糖电泳中DNA的回收10
1.2.6连接pEASYBlunt反应体系10
2 结果与分析 11
2.1突变体种子表现为粉质、不透明 11
2.2突变体种子粒长、粒宽、粒厚 11
2.3 FLO21的初定位 12
2.4 FLO21的精细定位 12
2.5候选基因的预测和测序 14
3 讨论 14
3.1 FLO21是一个未报道的新基因 14
3.2 水稻籽粒粉质突变体研究的应用前景 15
致谢15
参考文献15
水稻籽粒粉质突变体的基因定位
引言
淀粉是一种由大量单糖以糖苷键交联而成结构复杂的物质，其
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
种类可以大略分为直链淀粉与支链淀粉。直链淀粉为单糖由α1, 4糖苷键交联而成，很少出现分支，而支链淀粉具有高度分支，每有2025个α1, 4糖苷键就有一个α1, 6糖苷键分支，每个独立的分支可由6100个单糖构成。总的淀粉比重中，支链淀粉可以占到70%90%，同时能够形成结晶，出现不溶淀粉颗粒。这种淀粉颗粒密度高且稳定，是植物进化以适应环境变化的结果，可以使光合产物由可溶性糖转为更加容易被固定的物质。此外，淀粉颗粒中还含有极少量的蛋白质、脂肪和无机盐等。
当下，水稻中已经发现许多胚乳粉质突变体，这些突变位点的基因均未在淀粉合成中直接发挥作用，但其突变后都会开始对籽粒淀粉合成产生影响。这些基因的发现定位与克隆，均提升了我们对于水稻籽粒中淀粉合成的认识。同时也证明了筛选水稻淀粉突变体材料是寻找新的淀粉合成调控基因的有效办法，该方面的研究对于进一步探究淀粉的合成分子机制，提高水稻产量品质有着重要意义。水稻淀粉突变体包括糯性(waxy, wx)、糖质(sugary, su)、粉质 (floury, flo)、皱缩(shrunken, sh)、暗色(dull, du)、心白(whitecore, wc)等类型。其中研究的最早的突变体是wx，即糯米，在wx中，含有极少的直链淀粉，其淀粉几乎只含有支链淀粉。1988年就克隆到了Wx基因[1]。Wx基因位于第6染色体，由13个内含子和14个外显子组成[2]。Wx基因的表达具有时空特异性，在胚乳发育的早期表达，尤其在开花后56天表达量最高[3]，表达组织为胚乳、花粉、胚囊。Wx基因编码GBSSI蛋白，该蛋白起到延伸直链淀粉的作用，因此wx突变体中直链淀粉含量极低。Satoh et al.于1981年通过N甲基N亚硝基脲(MNU)处理受精卵得到了一系列淀粉粉质突变体，命名为floury1floury5[45]。其中flo2，flo4，flo5均已经得到克隆。flo4的基因序列是通过对TDNA插入片断侧翼序列进行扩增作业的方法获取的，在flo4突变体内，使用扫描电镜观察，发现其胚乳内部呈现粉质的状态并且出现排列松散的淀粉粒，但是其外圈是正常的表型。flo4的千粒重下降6%，而其总脂肪含量变高，脂肪的碘值下降，淀粉中直链淀粉的含量下降3%，但是总的淀粉量没有变化。flo4是是OsPPKDB基因编码的磷酸丙酮酸双激酶(Pyruvate orthophosphate Dikinase, PPDK)，其位于第5染色体，在受精后的生殖器官中表达，发育中的胚乳、糊粉层、盾片中的含量在其开花后10天表达量最高。[6]flo5突变体的种子中央部分出现粉质性状表现，外层无明显变化，据扫描电镜观察显示，其淀粉颗粒表现出更小更圆的性状，并且呈松散排布。flo5位于第8染色体，编码OsSSIIIa，在开花后 515 天表达量最大[7]。flo2编码一个具有未知功能的保守序列，在其氨基酸序列的中间区域含有三个 Tetratricopeptide Repeat(TPR)基序。flo2 突变体的整个籽粒都表现为粉质性状，通过电镜观察，其胚乳中所含淀粉颗粒与野生型进行比较要小，而且排列松散。flo2的籽粒在长度和宽度上都比较小。 FLO2位于第4染色体，含有23个外显子和22个内含子，主要在处于发育状态中的种子和叶片中表达，在茎、根、处于抽穗时期的小穗中却并没有表达，随着胚乳的发育表达量增加[8]。FLO1和FLO3这两个基因目前还没有被克隆。FLO1位于第5染色体，其胚乳呈现粉质，在I2KI溶液的作用下呈现蓝黑色，说明胚乳中淀粉种类主要是直链淀粉，属于非糯性变异，淀粉粒呈现松散排列的样子。而FLO3位于第4染色体。我们利用MNU诱变获得一系列具有粉质性状的突变体，并已成功克隆一个新基因，命名为FLO6。flo6突变体在水稻生长的幼苗期、分蘖期、抽穗期与野生型相比都没有明显差异，但在植株成熟时，粉质突变体的株高较野生型稍矮。在整个种子发育过程中，flo6突变体的灌浆速率明显低于野生型。从开花后半个月起，突变体的干物质积累速率明显低于野生型，并且这个差异一直维持到灌浆期结束。和flo6突变体中低的灌浆速率相一致的是突变体中淀粉含量也一直低于野生型。在灌浆期结束后，和野生型的种子相比，flo6突变体呈现出小而且粉质不透明的性状。通过扫描电镜进行观察籽粒断面，发现野生型籽粒中淀粉颗粒大小均匀，排列紧密整齐，而突变体中淀粉颗粒排列松散混乱，从而使得颗粒之间存在空隙。在光线通过时会发生漫反射与散射，导致flo6突变体籽粒外观呈现不透明表型。FLO6位于第三染色体长臂，编码一个特异性植物蛋白CBM48，其参与水稻胚乳中复合淀粉颗粒的形成[9]。Dull1基因是通过图位克隆的方法得到的，该基因位于第10染色体，编码合成一个mRNA前体加工蛋白，主要在胚乳细胞中进行表达。du1突变体的种子外观接近糯米，直链淀粉在胚乳中含量比糯米高，明显低于野生型。在du1突变体中Wxb基因的premRNA剪切效率下降 30%，而编码其他与淀粉合成有关酶的基因的剪切效率没有变化，这一现象说明 Du1能够对Wxb的剪切过程产生影响[10] 。dull3(du3)突变体的直链淀粉含量为7%，比du1 高，明显低于野生型。du3 中 Wxb基因premRNA 的剪切效率降低。通过图位克隆的方法将 du3 定位于第 2 染色体的长臂上，编码一个近似于人类CBP20(CapBinding Protein 20kD subunit)的蛋白，在将其定位到细胞核中，发现为帽结合复合物 (CapBinding Complex, CBC)的一个组成部件，参与到premRNA剪切和外运过程中[11]。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1材料的获得 5
1.1.1种子发苗方法 5
1.1.2 DNA的提取5
1.1.3 PCR扩增6
1.1.4 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)6
1.1.5 标记筛选及定位7
1.2 确定突变位点8
1.2.1 RNA提取8
1.2.2 RNA反转录扩增cDNA8
1.2.3利用KOD酶扩增基因9
1.2.4 琼脂糖电泳检测9
1.2.5 琼脂糖电泳中DNA的回收10
1.2.6连接pEASYBlunt反应体系10
2 结果与分析 11
2.1突变体种子表现为粉质、不透明 11
2.2突变体种子粒长、粒宽、粒厚 11
2.3 FLO21的初定位 12
2.4 FLO21的精细定位 12
2.5候选基因的预测和测序 14
3 讨论 14
3.1 FLO21是一个未报道的新基因 14
3.2 水稻籽粒粉质突变体研究的应用前景 15
致谢15
参考文献15
水稻籽粒粉质突变体的基因定位
引言
淀粉是一种由大量单糖以糖苷键交联而成结构复杂的物质，其
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
种类可以大略分为直链淀粉与支链淀粉。直链淀粉为单糖由α1, 4糖苷键交联而成，很少出现分支，而支链淀粉具有高度分支，每有2025个α1, 4糖苷键就有一个α1, 6糖苷键分支，每个独立的分支可由6100个单糖构成。总的淀粉比重中，支链淀粉可以占到70%90%，同时能够形成结晶，出现不溶淀粉颗粒。这种淀粉颗粒密度高且稳定，是植物进化以适应环境变化的结果，可以使光合产物由可溶性糖转为更加容易被固定的物质。此外，淀粉颗粒中还含有极少量的蛋白质、脂肪和无机盐等。
当下，水稻中已经发现许多胚乳粉质突变体，这些突变位点的基因均未在淀粉合成中直接发挥作用，但其突变后都会开始对籽粒淀粉合成产生影响。这些基因的发现定位与克隆，均提升了我们对于水稻籽粒中淀粉合成的认识。同时也证明了筛选水稻淀粉突变体材料是寻找新的淀粉合成调控基因的有效办法，该方面的研究对于进一步探究淀粉的合成分子机制，提高水稻产量品质有着重要意义。水稻淀粉突变体包括糯性(waxy, wx)、糖质(sugary, su)、粉质 (floury, flo)、皱缩(shrunken, sh)、暗色(dull, du)、心白(whitecore, wc)等类型。其中研究的最早的突变体是wx，即糯米，在wx中，含有极少的直链淀粉，其淀粉几乎只含有支链淀粉。1988年就克隆到了Wx基因[1]。Wx基因位于第6染色体，由13个内含子和14个外显子组成[2]。Wx基因的表达具有时空特异性，在胚乳发育的早期表达，尤其在开花后56天表达量最高[3]，表达组织为胚乳、花粉、胚囊。Wx基因编码GBSSI蛋白，该蛋白起到延伸直链淀粉的作用，因此wx突变体中直链淀粉含量极低。Satoh et al.于1981年通过N甲基N亚硝基脲(MNU)处理受精卵得到了一系列淀粉粉质突变体，命名为floury1floury5[45]。其中flo2，flo4，flo5均已经得到克隆。flo4的基因序列是通过对TDNA插入片断侧翼序列进行扩增作业的方法获取的，在flo4突变体内，使用扫描电镜观察，发现其胚乳内部呈现粉质的状态并且出现排列松散的淀粉粒，但是其外圈是正常的表型。flo4的千粒重下降6%，而其总脂肪含量变高，脂肪的碘值下降，淀粉中直链淀粉的含量下降3%，但是总的淀粉量没有变化。flo4是是OsPPKDB基因编码的磷酸丙酮酸双激酶(Pyruvate orthophosphate Dikinase, PPDK)，其位于第5染色体，在受精后的生殖器官中表达，发育中的胚乳、糊粉层、盾片中的含量在其开花后10天表达量最高。[6]flo5突变体的种子中央部分出现粉质性状表现，外层无明显变化，据扫描电镜观察显示，其淀粉颗粒表现出更小更圆的性状，并且呈松散排布。flo5位于第8染色体，编码OsSSIIIa，在开花后 515 天表达量最大[7]。flo2编码一个具有未知功能的保守序列，在其氨基酸序列的中间区域含有三个 Tetratricopeptide Repeat(TPR)基序。flo2 突变体的整个籽粒都表现为粉质性状，通过电镜观察，其胚乳中所含淀粉颗粒与野生型进行比较要小，而且排列松散。flo2的籽粒在长度和宽度上都比较小。 FLO2位于第4染色体，含有23个外显子和22个内含子，主要在处于发育状态中的种子和叶片中表达，在茎、根、处于抽穗时期的小穗中却并没有表达，随着胚乳的发育表达量增加[8]。FLO1和FLO3这两个基因目前还没有被克隆。FLO1位于第5染色体，其胚乳呈现粉质，在I2KI溶液的作用下呈现蓝黑色，说明胚乳中淀粉种类主要是直链淀粉，属于非糯性变异，淀粉粒呈现松散排列的样子。而FLO3位于第4染色体。我们利用MNU诱变获得一系列具有粉质性状的突变体，并已成功克隆一个新基因，命名为FLO6。flo6突变体在水稻生长的幼苗期、分蘖期、抽穗期与野生型相比都没有明显差异，但在植株成熟时，粉质突变体的株高较野生型稍矮。在整个种子发育过程中，flo6突变体的灌浆速率明显低于野生型。从开花后半个月起，突变体的干物质积累速率明显低于野生型，并且这个差异一直维持到灌浆期结束。和flo6突变体中低的灌浆速率相一致的是突变体中淀粉含量也一直低于野生型。在灌浆期结束后，和野生型的种子相比，flo6突变体呈现出小而且粉质不透明的性状。通过扫描电镜进行观察籽粒断面，发现野生型籽粒中淀粉颗粒大小均匀，排列紧密整齐，而突变体中淀粉颗粒排列松散混乱，从而使得颗粒之间存在空隙。在光线通过时会发生漫反射与散射，导致flo6突变体籽粒外观呈现不透明表型。FLO6位于第三染色体长臂，编码一个特异性植物蛋白CBM48，其参与水稻胚乳中复合淀粉颗粒的形成[9]。Dull1基因是通过图位克隆的方法得到的，该基因位于第10染色体，编码合成一个mRNA前体加工蛋白，主要在胚乳细胞中进行表达。du1突变体的种子外观接近糯米，直链淀粉在胚乳中含量比糯米高，明显低于野生型。在du1突变体中Wxb基因的premRNA剪切效率下降 30%，而编码其他与淀粉合成有关酶的基因的剪切效率没有变化，这一现象说明 Du1能够对Wxb的剪切过程产生影响[10] 。dull3(du3)突变体的直链淀粉含量为7%，比du1 高，明显低于野生型。du3 中 Wxb基因premRNA 的剪切效率降低。通过图位克隆的方法将 du3 定位于第 2 染色体的长臂上，编码一个近似于人类CBP20(CapBinding Protein 20kD subunit)的蛋白，在将其定位到细胞核中，发现为帽结合复合物 (CapBinding Complex, CBC)的一个组成部件，参与到premRNA剪切和外运过程中[11]。
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