黑麦特异标记的染色体定位研究
本实验室前期研究已利用高通量测序获得白粉菌诱导的荆州黑麦转录组序列，通过与小麦D基因组序列比对筛选出一批黑麦基因组特异序列并设计引物。本文在此基础上，利用辉县红、荆州黑麦和辉县红-荆州黑麦双倍体荆辉1号对设计的237对引物进行了扩增分析，结果表明，除17对引物在三个材料中均无扩增外，107对（45.1%）、182对（76.8%）和211对（89.0%）引物分别在小麦辉县红、荆州黑麦和荆辉1号中能稳定扩增，分析表明，237对引物产生80个荆州黑麦特异位点，多态率为33.76%。本文还利用涉及7条荆州黑麦染色体的异附加系对80个荆州黑麦特异标记进行了染色体定位，并利用19个涉及2R染色体的结构变异体对定位于2R染色体的标记Z3516和Z3452进行了染色体区段定位。
目录
摘要 3
关键词3
Abstract 3
Key words 3
引言3
1材料与方法 4
1.1 植物材料 4
1.2 引物来源 6
1.3 分子标记分析6
1.3.1 DNA的提取6
1.3.2 PCR扩增及扩增产物的分析6
2 结果与分析7
2.1 引物的扩增分析和荆州黑麦特意标记的分析7
2.2 荆州黑麦特异的分子标记的染色体定位 7
2. 3 2R染色体特异位点的染色体区段定位 9
3 讨论 9
3．1 基于RNAseq开发荆州黑麦的特异标记的特点10
3.2 荆州黑麦的特异意标记的染色体定位10
3.3 荆州黑麦特异标记的应用分析10
致谢10
参考文献11
荆州黑麦特异标记的染色体定位研究
引言
引言
我国栽培黑麦品种荆州黑麦（Secale cereale L. cv. Jingzhouheimai, JZHM）高抗白粉病、黄花叶病和纹枯病，在其染色体2R和6R上均发现抗白粉病基因[1]。但由于这些染色体在携带有利基因的同时还携带不利基因，因此培育仅具目标基因的小片段易位系是利用这些基因的有效途径。筛选出足够多的荆州黑麦染色体
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
特异分子标记有利于小片段易位系的辅助选择和准确鉴定。
检测导入小麦背景中的黑麦染色质的分子标记的方法有两种，第一类是染色体组专化标记，是从整个基因组的角度建立了黑麦专化标记，它们分布在黑麦多条染色体上。这类基于黑麦重复序列的分子标记是鉴定小麦背景中黑麦染色体或片段的理想工具[2]，具有检测全面的优点[3]，特别适合于进行杂交的低世代标记辅助选择，应受到研究者的重视。
第二类是染色体专化标记，它们分布在黑麦单条染色体上[4]。Hackauf and Wehling[5]利用黑麦EST，开发出了157个黑麦微卫星SCM（Secale cereale microsatellite）标记，其中一部分已经定位在黑麦不同染色体上[6]。Saal et al.比较发现，SSR比RFLP标记更具应用潜力。
新一代测序技术已经广泛应用于转录组的研究（即RNAseq[7]），其数据几乎涵盖了特定组织和特定时期的所有转录本[8]。由于其具有高通量和低成本的优势，RNAseq越来越受到研究者的青睐[9]，特别是在那些缺乏基因组信息的物种上。RNAseq数据对于SSR和SNP等分子标记的开发是非常有用的[10]， 由于这些标记在相关物种中有很高的通用性[11]，因此在染色体工程和比较作图中有其不可替代的优势[12]。李晨旭等[13]利用高通量测序的方式获得百萨偃麦草转录组序列，将其与粗山羊草D基因组序列比对，筛选出百萨偃麦草特异的序列进行引物设计，342对百萨偃麦草转录组开发的引物在辉县红、荆州黑麦、辉县红荆州黑麦双倍体荆辉1号和百萨偃麦草中的扩增分析发现，194对引物（56.7%）在4个模板上均可以稳定扩增，其中50对（14.6%）在辉县红和辉县红荆州黑麦双二倍体扩增出多态性位点，可以作为黑麦基因组的特异标记。为开发更多荆州黑麦特异标记，获得与白粉病抗性相关的功能标记，本实验收集了南京地区白粉菌混合生理小种，于苗期（23叶期）对荆州黑麦进行接种，分别提取白粉菌诱导前和诱导后6 h、12 h和24 h的荆州黑麦RNA，利用白粉菌诱导前RNA和诱导6 h、12 h和24 h后RNA的等量混合样品分别构建了两个cDNA文库，获得87119 条EST 序列，经拼接组装后获得46810条contigs序列（刘朋[14]）。
丁桃春[15]利用本地比对将这些序列与小麦D基因组序列进行了比对，获得了3602条荆州黑麦特异序列，并据此设计了237对引物。本研究即在此基础上，利用辉县红、荆州黑麦和辉县红荆州黑麦双倍体荆辉1号对这些引物进行了初步扩增分析，对其扩增情况进行了分析，筛选荆州黑麦特异标记，利用新配套的小麦荆州黑麦异染色体系进行染色体定位，并利用19个涉及2R染色体的结构变异体对定位于2R染色体特异标记进行了区段定位。
1 材料与方法
1．1 植物材料
普通小麦地方品种辉县红（T. aestivum landrace Huixianhong, HXH）与荆州黑麦保存于大学细胞遗传所；辉县红荆州黑麦双二倍体荆辉1号（Jinghui 1）由大学细胞遗传所创制并保存；辉县红荆州黑麦异染色体系及2R染色体长臂端体、短臂端体（表1）；2R染色体结构变异体由刘朋[14]选育（表2）。
表1 辉县红荆州黑麦异染色体系及其染色体组成
Table 1 Plant materials and chromosome constitution used in this study
材料
Material
染色体数（2n）
Chromosome number
染色体组成
Chromosome constitution
辉县红（HXH）
42
21″
荆州黑麦（JZHM）
14
7″R
荆辉1号（Jinghui 1）
56
21″+7″R
HJ DA1R
44
21″+1″1R
HJ DA2R1
44
21″+1″2R
HJ DA2R2
44
21″+1″2R
HJ DtA2RS
44
21″+1″2RS
HJ DtA2RL
44
21″+1″2RL
HJ MA3R
43
21″+1′3R
HJ MA4R
43
21″+1′4R
HJ DA5R
目录
摘要 3
关键词3
Abstract 3
Key words 3
引言3
1材料与方法 4
1.1 植物材料 4
1.2 引物来源 6
1.3 分子标记分析6
1.3.1 DNA的提取6
1.3.2 PCR扩增及扩增产物的分析6
2 结果与分析7
2.1 引物的扩增分析和荆州黑麦特意标记的分析7
2.2 荆州黑麦特异的分子标记的染色体定位 7
2. 3 2R染色体特异位点的染色体区段定位 9
3 讨论 9
3．1 基于RNAseq开发荆州黑麦的特异标记的特点10
3.2 荆州黑麦的特异意标记的染色体定位10
3.3 荆州黑麦特异标记的应用分析10
致谢10
参考文献11
荆州黑麦特异标记的染色体定位研究
引言
引言
我国栽培黑麦品种荆州黑麦（Secale cereale L. cv. Jingzhouheimai, JZHM）高抗白粉病、黄花叶病和纹枯病，在其染色体2R和6R上均发现抗白粉病基因[1]。但由于这些染色体在携带有利基因的同时还携带不利基因，因此培育仅具目标基因的小片段易位系是利用这些基因的有效途径。筛选出足够多的荆州黑麦染色体
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
特异分子标记有利于小片段易位系的辅助选择和准确鉴定。
检测导入小麦背景中的黑麦染色质的分子标记的方法有两种，第一类是染色体组专化标记，是从整个基因组的角度建立了黑麦专化标记，它们分布在黑麦多条染色体上。这类基于黑麦重复序列的分子标记是鉴定小麦背景中黑麦染色体或片段的理想工具[2]，具有检测全面的优点[3]，特别适合于进行杂交的低世代标记辅助选择，应受到研究者的重视。
第二类是染色体专化标记，它们分布在黑麦单条染色体上[4]。Hackauf and Wehling[5]利用黑麦EST，开发出了157个黑麦微卫星SCM（Secale cereale microsatellite）标记，其中一部分已经定位在黑麦不同染色体上[6]。Saal et al.比较发现，SSR比RFLP标记更具应用潜力。
新一代测序技术已经广泛应用于转录组的研究（即RNAseq[7]），其数据几乎涵盖了特定组织和特定时期的所有转录本[8]。由于其具有高通量和低成本的优势，RNAseq越来越受到研究者的青睐[9]，特别是在那些缺乏基因组信息的物种上。RNAseq数据对于SSR和SNP等分子标记的开发是非常有用的[10]， 由于这些标记在相关物种中有很高的通用性[11]，因此在染色体工程和比较作图中有其不可替代的优势[12]。李晨旭等[13]利用高通量测序的方式获得百萨偃麦草转录组序列，将其与粗山羊草D基因组序列比对，筛选出百萨偃麦草特异的序列进行引物设计，342对百萨偃麦草转录组开发的引物在辉县红、荆州黑麦、辉县红荆州黑麦双倍体荆辉1号和百萨偃麦草中的扩增分析发现，194对引物（56.7%）在4个模板上均可以稳定扩增，其中50对（14.6%）在辉县红和辉县红荆州黑麦双二倍体扩增出多态性位点，可以作为黑麦基因组的特异标记。为开发更多荆州黑麦特异标记，获得与白粉病抗性相关的功能标记，本实验收集了南京地区白粉菌混合生理小种，于苗期（23叶期）对荆州黑麦进行接种，分别提取白粉菌诱导前和诱导后6 h、12 h和24 h的荆州黑麦RNA，利用白粉菌诱导前RNA和诱导6 h、12 h和24 h后RNA的等量混合样品分别构建了两个cDNA文库，获得87119 条EST 序列，经拼接组装后获得46810条contigs序列（刘朋[14]）。
丁桃春[15]利用本地比对将这些序列与小麦D基因组序列进行了比对，获得了3602条荆州黑麦特异序列，并据此设计了237对引物。本研究即在此基础上，利用辉县红、荆州黑麦和辉县红荆州黑麦双倍体荆辉1号对这些引物进行了初步扩增分析，对其扩增情况进行了分析，筛选荆州黑麦特异标记，利用新配套的小麦荆州黑麦异染色体系进行染色体定位，并利用19个涉及2R染色体的结构变异体对定位于2R染色体特异标记进行了区段定位。
1 材料与方法
1．1 植物材料
普通小麦地方品种辉县红（T. aestivum landrace Huixianhong, HXH）与荆州黑麦保存于大学细胞遗传所；辉县红荆州黑麦双二倍体荆辉1号（Jinghui 1）由大学细胞遗传所创制并保存；辉县红荆州黑麦异染色体系及2R染色体长臂端体、短臂端体（表1）；2R染色体结构变异体由刘朋[14]选育（表2）。
表1 辉县红荆州黑麦异染色体系及其染色体组成
Table 1 Plant materials and chromosome constitution used in this study
材料
Material
染色体数（2n）
Chromosome number
染色体组成
Chromosome constitution
辉县红（HXH）
42
21″
荆州黑麦（JZHM）
14
7″R
荆辉1号（Jinghui 1）
56
21″+7″R
HJ DA1R
44
21″+1″1R
HJ DA2R1
44
21″+1″2R
HJ DA2R2
44
21″+1″2R
HJ DtA2RS
44
21″+1″2RS
HJ DtA2RL
44
21″+1″2RL
HJ MA3R
43
21″+1′3R
HJ MA4R
43
21″+1′4R
HJ DA5R
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