大豆质核互作雄性不育novelmir006克隆及其靶基因功能阐述
作物杂种优势利用是提高大豆产量的一条有效途径，质核互作雄性不育[1]在杂种优势利用中具有重要作用。对大豆质核互作雄性不育花粉败育的调控机理研究有助于我们更好的了解不育系材料从而对其进行改良。 miRNAs 是生物体内一类长约21 nt 的小分子RNA，其对真核生物的基因表达起非常重要的调控作用。大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A及其保持系NJCMS1B[2]小RNA测序结果显示，novel_mir_006-3p只在不育系中表达。Stem-loop quantitative real-time PCR分析表明其在不育系中为上调表达，与测序结果相符合。降解组[3]分析表明，该miRNA的靶基因为mtHSP70，相关报道mtHSP70与植物雄性不育存在很大联系。Quantitative real-time PCR 分析显示mtHSP70在不育系中为下调表达，从而与novel_mir_006-3p表达量存在负向调控的关系。本研究通过对novel_mir_006-3p进行克隆来研究其在大豆质核互作雄性不育中的功能。
目录
摘要 3
引言
引言
细胞质雄性不育系在杂种优势利用和作物育种中具有重大作用和意义。玉米、水稻、高粱、小麦、油菜等的细胞质雄性不育系已在作物育种中发挥了巨大作用。大豆作为重要的经济作物，在雄性不育的研究方面还不够系统。为了在理论上阐明细胞质雄性不育机理, 研究者们己从线粒体DNA差异、类质粒、嵌合基因、RNA编辑以及蛋白质翻译等多个层面对植物CMS进行了相关研究,并取得了突破性的进展。 而microRNA作为生物体内重要的调控分子, 在近年来越来越受到研究者们的重视, 这些小分子RNA在植物发育、环境适应以及抗逆等方面的调控功能己经得到了大量研究结果的证实, 人们甚至认为microRNA是另一种新层面的基因调控。鉴于对植物CMS的研究结果证明, 细胞质雄性不育性[4]涉及到基因重排、基因转录调控和基因翻译调控等多个方面, 而这些过程都能为microRNA调控作用提供了施展的空间。另外,细胞质雄性不育材料在花粉败育过程中所经历的生理代谢过程也为microRNA的调控提供了场所。
大豆质核互作雄性不育系[5]NJCMS1A及其保持系NJCMS1B小RNA测序结果显示
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
，novel_mir_0063p只在不育系中表达。Stemloop quantitative realtime PCR分析表明其在不育系中为上调表达，与测序结果相符合。降解组分析表明，该miRNA的靶基因为mtHSP70，相关报道mtHSP70与植物雄性不育存在很大联系。Quantitative realtime PCR 分析显示mtHSP70在不育系[6]中为下调表达，从而与novel_mir_0063p表达量存在负向调控的关系。本研究通过对novel_mir_0063p进行克隆来研究其在大豆质核互作雄性不育[7]中的功能。
1 材料与方法
1.1 研究材料
1.2 novel_mir_006 序列来源
1.3 菌株与载体
本研究采用的大肠杆菌菌株DH5α（天根）购于南京阿恩地生物科技发展有限公司；克隆载体pMD19T （Takara）购于上海皓嘉科技发展有限公司。
1.4 酶和其他试剂耗材
高效率PCR酶KOD Plus（Toyobo）东洋纺(上海)生物科技有限公司；Ex Taq酶（Takara）购于上海皓嘉科技发展有限公司；枪头和离心管购于Axygen公司，其他化学试剂、药品为国产分析纯。
1.5 试剂盒
DNA胶回收试剂盒购于Axygen公司；DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒（天根）购于南京阿恩地生物科技发展有限公司；cDNA反转试剂盒、实时荧光定量试剂盒（BioRad）购于南京润亚生物科技发展有限公司。
1.6 主要仪器
凝胶成像系统（上海培清）、恒温摇床（Orbital Shaker Incubator）、PCR仪（北京东胜创新）、恒温水浴锅（Multi TempⅢ）、超净工作台（ARI TECH）、高速冷冻离心机（Eppendorf）、荧光定量PCR仪（BioRad CFX96）。
1.7 引物和测序
采用Primer Premier 5软件设计引物，引物合成及测序由上海英骏生物技术有限公司完成。
2 方法与步骤
2.1 novel_mir_006小RNA测序结果信息、前体二次结构预测及靶基因验证
根据novel_mir_006前体序列通过MFOLD在线预测其二级结构。通过实验室已做的降解组测序验证该miRNA的靶基因。
2.2 材料育性观察
材料生长期间，通过花药散粉性、花粉碘染、花粉萌发率和植株成熟期表现等方法来鉴定不育株。
2.3 样品采集
大豆盛花期间，分别采集败育前的NJCMS1A和NJCMS1B不同大小的花芽以及叶片放于冻存管中，立即置于液氮中，然后转至80℃超低温冰箱保存，用于后期实验。
2.4 DNA提取
DNA提取参照使用天根公司的DNA提取试剂盒说明书进行,具体步骤如下：用于novel_mir_006的前体克隆实验。
2.5 RNA提取
RNA提取参照使用天根公司的RNA提取试剂盒说明书进行,具体步骤如下： 用于novel_mir_006成熟体及其靶基因的表达分析实验。
2.6 PCR产物凝胶回收
按照 Axygen 公司 DNA 凝胶回收试剂盒回收纯化 PCR 扩增产物。
2.7 PCR产物的克隆
（1）根据novel_mir_006的前体序列在NCBI数据库中Blast找到其所在大豆基因组位置并各向两端延生100bp，然后使用Primer Premier 5软件在延伸的100bp中设计一对引物，引物序列为：
novel_mir_006 F:5’ TCATGTAATGTTCGTCCTCCAGTC3’
novel_mir_006 R:5’ AATCATGCAATGTTGGTCCCTC3’
（2）以 DNA 为模板，使用Takara公司的KODPlus酶 进行 PCR 扩增，PCR 反应体系为：
Components
Volume (ul)
2×PCR Buffer
25
2 mM dNTPs
10
KOD DNA polymerase
1
DNA
2
Forward primer
1
Reverse primer
1
ddH2O
10
Total
50
目录
摘要 3
引言
引言
细胞质雄性不育系在杂种优势利用和作物育种中具有重大作用和意义。玉米、水稻、高粱、小麦、油菜等的细胞质雄性不育系已在作物育种中发挥了巨大作用。大豆作为重要的经济作物，在雄性不育的研究方面还不够系统。为了在理论上阐明细胞质雄性不育机理, 研究者们己从线粒体DNA差异、类质粒、嵌合基因、RNA编辑以及蛋白质翻译等多个层面对植物CMS进行了相关研究,并取得了突破性的进展。 而microRNA作为生物体内重要的调控分子, 在近年来越来越受到研究者们的重视, 这些小分子RNA在植物发育、环境适应以及抗逆等方面的调控功能己经得到了大量研究结果的证实, 人们甚至认为microRNA是另一种新层面的基因调控。鉴于对植物CMS的研究结果证明, 细胞质雄性不育性[4]涉及到基因重排、基因转录调控和基因翻译调控等多个方面, 而这些过程都能为microRNA调控作用提供了施展的空间。另外,细胞质雄性不育材料在花粉败育过程中所经历的生理代谢过程也为microRNA的调控提供了场所。
大豆质核互作雄性不育系[5]NJCMS1A及其保持系NJCMS1B小RNA测序结果显示
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
，novel_mir_0063p只在不育系中表达。Stemloop quantitative realtime PCR分析表明其在不育系中为上调表达，与测序结果相符合。降解组分析表明，该miRNA的靶基因为mtHSP70，相关报道mtHSP70与植物雄性不育存在很大联系。Quantitative realtime PCR 分析显示mtHSP70在不育系[6]中为下调表达，从而与novel_mir_0063p表达量存在负向调控的关系。本研究通过对novel_mir_0063p进行克隆来研究其在大豆质核互作雄性不育[7]中的功能。
1 材料与方法
1.1 研究材料
1.2 novel_mir_006 序列来源
1.3 菌株与载体
本研究采用的大肠杆菌菌株DH5α（天根）购于南京阿恩地生物科技发展有限公司；克隆载体pMD19T （Takara）购于上海皓嘉科技发展有限公司。
1.4 酶和其他试剂耗材
高效率PCR酶KOD Plus（Toyobo）东洋纺(上海)生物科技有限公司；Ex Taq酶（Takara）购于上海皓嘉科技发展有限公司；枪头和离心管购于Axygen公司，其他化学试剂、药品为国产分析纯。
1.5 试剂盒
DNA胶回收试剂盒购于Axygen公司；DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒（天根）购于南京阿恩地生物科技发展有限公司；cDNA反转试剂盒、实时荧光定量试剂盒（BioRad）购于南京润亚生物科技发展有限公司。
1.6 主要仪器
凝胶成像系统（上海培清）、恒温摇床（Orbital Shaker Incubator）、PCR仪（北京东胜创新）、恒温水浴锅（Multi TempⅢ）、超净工作台（ARI TECH）、高速冷冻离心机（Eppendorf）、荧光定量PCR仪（BioRad CFX96）。
1.7 引物和测序
采用Primer Premier 5软件设计引物，引物合成及测序由上海英骏生物技术有限公司完成。
2 方法与步骤
2.1 novel_mir_006小RNA测序结果信息、前体二次结构预测及靶基因验证
根据novel_mir_006前体序列通过MFOLD在线预测其二级结构。通过实验室已做的降解组测序验证该miRNA的靶基因。
2.2 材料育性观察
材料生长期间，通过花药散粉性、花粉碘染、花粉萌发率和植株成熟期表现等方法来鉴定不育株。
2.3 样品采集
大豆盛花期间，分别采集败育前的NJCMS1A和NJCMS1B不同大小的花芽以及叶片放于冻存管中，立即置于液氮中，然后转至80℃超低温冰箱保存，用于后期实验。
2.4 DNA提取
DNA提取参照使用天根公司的DNA提取试剂盒说明书进行,具体步骤如下：用于novel_mir_006的前体克隆实验。
2.5 RNA提取
RNA提取参照使用天根公司的RNA提取试剂盒说明书进行,具体步骤如下： 用于novel_mir_006成熟体及其靶基因的表达分析实验。
2.6 PCR产物凝胶回收
按照 Axygen 公司 DNA 凝胶回收试剂盒回收纯化 PCR 扩增产物。
2.7 PCR产物的克隆
（1）根据novel_mir_006的前体序列在NCBI数据库中Blast找到其所在大豆基因组位置并各向两端延生100bp，然后使用Primer Premier 5软件在延伸的100bp中设计一对引物，引物序列为：
novel_mir_006 F:5’ TCATGTAATGTTCGTCCTCCAGTC3’
novel_mir_006 R:5’ AATCATGCAATGTTGGTCCCTC3’
（2）以 DNA 为模板，使用Takara公司的KODPlus酶 进行 PCR 扩增，PCR 反应体系为：
Components
Volume (ul)
2×PCR Buffer
25
2 mM dNTPs
10
KOD DNA polymerase
1
DNA
2
Forward primer
1
Reverse primer
1
ddH2O
10
Total
50
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